De la onda T de movilidad de iones-espectrometría de masas: Basic Procedimientos experimentales para el análisis de proteínas complejas

El objetivo general del siguiente experimento es determinar la forma tridimensional de los complejos proteicos. Esto se logra obteniendo datos de movilidad iónica por espectrometría de masas para iones de complejos proteicos y midiendo los valores de tiempo de deriva de cada estado de carga. Como segundo paso, se validan las condiciones experimentales para asegurar mediciones de movilidad de estructuras proteicas nativas.

A continuación, los valores medidos del tiempo de deriva se correlacionan con las áreas de sección transversal. Los resultados determinan los valores de sección transversal de colisión de proteínas o complejos proteicos con estructuras tridimensionales desconocidas. Esta información proporciona indicios sobre su forma general, empaquetamiento de subunidades y topología.

Hola, soy Isaac Leski del Laboratorio de Mic, del departamento de Química Biológica en el Instituto de Ciencias Wiseman, y soy Naam Kirschenbaum, también del laboratorio de mi. Hoy mostraremos un procedimiento para medir la sección transversal de colisión de complejos proteicos utilizando espectrometría de masas híbrida e instrumentos de movilidad iónica.

Entonces, comencemos. Este procedimiento se centra en la movilidad del hierro, el análisis por espectrometría de masas o IMM MS de complejos proteicos. Los pasos de preparación de la muestra, la calibración del instrumento y los procedimientos de optimización de la MS y la MS en tándem se demuestran en un protocolo JOVE relacionado.

En general, este protocolo implica concentraciones de micromolar bajo del complejo en un tampón volátil como acetato de amonio. Dado que se consumen uno a dos microlitros por capilar de flujo nano, prepare de 10 a 20 microlitros como volumen mínimo para permitir la optimización de las condiciones de espectrometría de masas. Para comenzar este procedimiento, configure la onda viajera o sinap IMMS de onda T en los siguientes modos de operación: movilidad TOF, en el cual las ondas tri y las presiones se ajustan automáticamente tanto para la separación iónica por movilidad como por tiempo de vuelo, adquisición en modo ión positivo y modo V, estableciendo la trayectoria de los iones a través del tubo de vuelo y activando todos los gases aquí.

Se utiliza nitrógeno para la separación en el IM y argón para las regiones de trampa y transferencia. Los valores iniciales recomendados son un flujo de gas de 24 mililitros por minuto para el dispositivo IMS y 1,5 mililitros por minuto para la región de trampa. A continuación, establezca el rango de adquisición de la relación de carga del mastil para un complejo proteico desconocido.

Utilice inicialmente un rango amplio de masas, que luego puede reducirse a los valores deseados; ajuste el perfil de MS en consecuencia. Para obtener la máxima eficiencia de transmisión para complejos grandes, el rango de masas de adquisición debe establecerse entre 1030 y 2000 de relación masa/carga y el perfil de MS en automático. En caso contrario, el perfil puede ajustarse según el gráfico mostrado.

Verifique la configuración de RF y, si es necesario, ajústela a los valores adecuados para complejos proteicos grandes, como se muestra. A continuación, cargue la muestra, aplique el voltaje capilar y una presión baja de flujo nano. Una vez iniciadas las pulverizaciones, intente reducir la presión de flujo nano a un valor mínimo.

Además, ajuste la posición del capilar con respecto al cono y ajuste los parámetros de adquisición del espectrómetro de masas para obtener un espectro de MS bien resuelto. Optimice el gradiente de presión a lo largo del instrumento y del cono de muestreo, así como los ajustes de potencial del trampa de sesgo del cono de extracción y del cono de transferencia, tal como se detalla en el protocolo asociado de JoVE. Aunque estos parámetros dependen de la muestra, a continuación se indican las condiciones utilizadas para adquirir espectros de MS de diversas masas de hierro, desde péptidos hasta complejos proteicos.

Los iones grandes requieren energías de colisión y voltajes de polarización más altos. También se recomienda aumentar la presión posterior para el análisis de complejos proteicos grandes con el fin de minimizar la activación del complejo. Intente reducir gradualmente en pasos de aproximadamente 10 voltios los voltajes de extracción del cono de muestra, del trampa de cono y de polarización sin cambiar la posición del pico.

Una vez que se obtiene un espectro de masas óptimo, se debe ajustar el tiempo de deriva o el perfil de movilidad iónica al analizar ensamblajes proteicos. Las condiciones óptimas para las mediciones de masa y movilidad a menudo son incompatibles. Por lo tanto, es importante encontrar el equilibrio adecuado entre ambas.

En general, el gráfico de movilidad del hierro debe optimizarse de modo que los picos se distribuyan a lo largo de todo el rango de tiempo de deriva y el perfil del pico sea suave. Al aproximarse a una distribución gaussiana, una asimetría significativa del pico puede estar relacionada con una mala separación de múltiples conformaciones. La velocidad de la onda T, la altura de la onda T y la velocidad de flujo del gas IMS pueden ajustarse para optimizar la separación por movilidad. Aumentar la velocidad de la onda T amplía el perfil de distribución del tiempo de deriva.

Mientras que valores más altos de altura de la onda T la reducen de forma similar, aumentar el flujo de gas IMS a partir de un mínimo de 10 mililitros por minuto desplaza el perfil del tiempo de deriva hacia valores más altos, lo que permite optimizar el espectro de movilidad del hierro. Fijando dos de las tres variables y optimizando la tercera, establezca la velocidad de la onda T en 250 metros por segundo y el flujo de gas en 24 mililitros por minuto. Luego, como punto inicial, fije la altura en tres voltios y, de manera progresiva, aumente esta en incrementos de un voltio.

Cuando se utilizan voltajes de polarización elevados, se recomienda reducir la presión del gas en la IMS y, de este modo, permitir la disminución del voltaje de polarización. Como consecuencia, se reducirán las activaciones y disociaciones complejas. Puede aparecer un efecto de inversión cuando las condiciones no están optimizadas, observado como un pico idéntico en la parte inicial del espectro de tiempos de deriva y en el borde de cola.

Cuando los iones no atraviesan el dispositivo IAM, efectivamente su recorrido puede tardar más que el tiempo necesario para que se libere el siguiente paquete de iones en la celda de movilidad. Como resultado, un nuevo grupo de iones se libera desde la región de trampa antes de que el paquete anterior haya sido entregado a la región de impulso. Para eliminar este artefacto, aumente la altura de la onda T y disminuya la velocidad de la onda T y la presión IMS.

Además, se puede ajustar el tiempo de liberación de la trampa. Asimismo, es importante validar que la altura de la onda de transferencia T se establezca en al menos cinco voltios. También para prevenir la fuga de iones hacia la celda de IMS.

La altura de la trampa de movilidad debe mantenerse en niveles máximos. Una velocidad baja y una amplitud alta de las ondas de transferencia T pueden provocar ondulaciones en el perfil de distribución del tiempo de deriva. Este artefacto ocurre cuando la separación por movilidad de los iones no se mantiene a través de las regiones de transferencia y dificultad debido a una sincronización parcial entre la frecuencia de impulso y la velocidad de la onda T de transferencia.

Para eliminar este efecto, se debe ajustar ya sea el tiempo del impulsor o la velocidad de la onda de transferencia T. Dado que la frecuencia del impulsor está relacionada con el rango de masas, este artefacto podría reaparecer cuando se cambia este parámetro.

La altura de la onda T ejerce un efecto menor. Aunque su reducción también puede ayudar a eliminar ondulaciones. Una vez que se han optimizado los parámetros mencionados, se pueden adquirir los datos de IMMS para lograr una alta resolución.

Los complejos proteicos MS.Peaks a menudo se activan dentro del espectrómetro de masas para favorecer la eliminación de agua residual y componentes del tampón. Sin embargo, si la energía de activación aumenta más allá de un valor umbral, puede ocurrir un desnaturalización parcial que forma múltiples estados intermedios, los cuales es improbable que correspondan a la estructura nativa en estado de solución. Como resultado, el pico de tiempo de deriva puede desplazarse y ensancharse, reflejando la población heterogénea de estructuras desnaturalizadas.

Para obtener datos de tiempo de deriva consistentes con las estructuras en fase solución, es esencial controlar cuidadosamente los voltajes utilizados para acelerar los iones antes de la separación por movilidad iónica; por lo tanto, aumente de manera escalonada el voltaje del capilar y del cono mientras monitorea el efecto sobre el espectro de tiempo de deriva. Además, para lograr una alta resolución en MS, es preferible aumentar el voltaje de transferencia en lugar del voltaje de trampa. Primero se encuentra el dispositivo de movilidad iónica, seguido por la región de transferencia y el analizador TOF.

Dado que la activación sigue a la medición de IM, los resultados permanecen inalterados para IM, mientras que la precisión de MS puede aumentarse para asegurar que la adquisición de datos se realice bajo condiciones que mantengan la estructura nativa del complejo, es importante recopilar datos a lo largo de un rango de condiciones experimentales y en solución, en lugar de ceñirse a un único conjunto optimizado de parámetros. Por esta razón, aumente el voltaje de colisión del trampa de manera escalonada y adquiera datos a intervalos de 10 voltios, monitoreando simultáneamente el efecto sobre el perfil de movilidad del hierro. Finalmente, para identificar las conformaciones desnaturalizadas y evaluar los datos adquiridos, induzca manualmente la disociación del complejo proteico mediante la titulación de la muestra con ácido acético en un rango de pH de dos a siete, registre los datos y proceda a analizarlos en el sistema T wave IMS, determinando las áreas transversales mediante un enfoque de calibración del tiempo de deriva, utilizando proteínas Cain con valores de sección transversal conocidos.

Primero, prepare soluciones de proteínas patrón desnaturalizadas a 10 micromolares cada una. Utilice citocromo C de caballo, mioglobina de corazón y ubiquitina bovina en una proporción de volumen 49:49:0,2 de agua, metanol y ácido acético. A continuación, obtenga los datos de IMMS para las proteínas patrón bajo exactamente las mismas condiciones instrumentales utilizadas para la proteína objetivo o el complejo proteico; mantenga todos los voltajes y valores de presión idénticos para preservar los parámetros de separación IM.

Después de adquirir los datos, extraiga el valor experimental de tiempo de deriva para cada carga. El estado de las proteínas Cain corrige cada uno de los tiempos de deriva calibrados T prima D utilizando la siguiente ecuación, donde MOVZ es la relación de carga maestra del ion observado, y C es el coeficiente de retardo del ciclo de trabajo mejorado EDC. Su valor, que generalmente oscila entre 1,4 y 1,6, depende del instrumento.

El valor de EDC se indica dentro de la configuración de adquisición del sistema, en la pestaña de ajuste de adquisición, corrigiendo cada una de las secciones transversales de calibre para ambos estados de carga del hierro y la masa reducida. Donde omega C es la sección transversal corregida, omega es la sección transversal de la literatura, Z es el estado de carga del hierro, M es el peso molecular del ion de cain y MG es el peso molecular del hierro.

Gas de fondo, que típicamente es nitrógeno plop elthan de T prima D frente althan de omega C. La curva resultante corresponde a la siguiente ecuación. Los parámetros X y A pueden extraerse ajustando la gráfica a una relación lineal. La pendiente X corresponde al factor de proporción exponencial, y A representa la constante determinada mediante el ajuste.

Calcule el coeficiente de correlación del ajuste R cuadrado. Los valores aceptables para R cuadrado son superiores a 0,95. Un valor más bajo del coeficiente de correlación puede deberse a un desnaturalización incompleta de la proteína o al envejecimiento de la muestra.

Condiciones experimentales diferentes utilizadas para proteínas de distinto calibre, espectro ruidoso e incompleta procesamiento de los datos o error de cálculo. Corrija el tiempo de deriva del ca utilizando el factor exponencial X determinado y valide sus cálculos mediante la representación nuevamente de omega C frente a T prima D. Vuelva a definir el coeficiente de correlación. Se esperan valores superiores a 0,95, de forma similar a los pasos descritos anteriormente; corrija el tiempo de deriva medido de la proteína diana o del complejo proteico y calibre el tiempo de deriva de la proteína diana o del complejo proteico utilizando el factor exponencial X calculado. Calcule omega de la proteína diana o del complejo proteico utilizando la constante A determinada por el ajuste, donde omega es igual a a TD. Repita estos pasos para cada condición experimental.

Al definir el área de la sección transversal de la proteína desconocida o del complejo proteico, se recomienda repetir cada experimento al menos tres veces y determinar la desviación estándar de estas mediciones triplicadas una vez que se hayan obtenido los valores de la sección transversal de colisión. Se emplean enfoques de modelado para predecir la topología o disposición del complejo. Esto se realiza ajustando los valores experimentales de la sección transversal de colisión con los valores Omega calculados in silico a partir de estructuras modelo generadas. En conjunto, este campo aún se encuentra en sus primeros años y se requiere un mayor desarrollo para hacer este enfoque genérico y aplicable a una amplia gama de complejos.

Se muestra aquí la representación de la superficie de la forma tetramérica de la hemoglobina bovina. El complejo transportador de oxígeno, hemoglobina, puede servir como ejemplo para el enfoque mencionado anteriormente. La hemoglobina es un complejo proteico tetramérico compuesto por dos subunidades alfa y dos subunidades beta, coloreadas en azul y rojo respectivamente, que forman un dímero de dímeros alfa-beta.

El espectro IMMS de la hemoglobina se muestra aquí. El espectro IM ms adquirido del complejo revela una distribución principal de series de cargas correspondiente al complejo intacto y series de cargas menores, que coinciden con las masas del dímero alfa-beta y las subunidades monoméricas alfa y beta. Aquí se muestran el CCS teórico y el medido de las diferentes formas de la hemoglobina.

Se utilizaron los valores de tiempo de deriva obtenidos para varios estados de carga de las formas diméricas y tetraméricas para calcular los valores de omega. Estos se compararon con los valores teóricos. Dado que un complejo tetramérico tiene tres posibilidades de asociación: empaquetamientos cíclicos, diédricos o en forma de cadena.

Al calcular el aumento en omega al pasar de un dímero a un tetrámero, se puede predecir la organización estructural. Estudios previos y nuestros propios experimentos han mostrado una fuerte correlación entre las ccss medidas y las áreas superficiales de las proteínas derivadas de datos estructurales cristalográficos. Esta correlación puede utilizarse para calcular el aumento esperado en el área superficial de un tetrámero en comparación con un dímero para las diferentes formas de empaquetamiento.

Esto se realiza considerando cada subunidad como un objeto asférico. Un ensamblaje en forma de cadena aumentará la CCS del tetrámero aproximadamente al doble, mientras que un empaquetamiento C4 o D2 producirá un aumento de aproximadamente 1,5 y 1,67, respectivamente. La relación calculada entre los valores medidos de CCS de las formas tetramérica y DME de la hemoglobina fue de 1,57 ± 0,03.

Este número indica que la estructura nativa no está organizada linealmente, sino que se dispone en una forma más compacta, ya sea como un tetrámero cíclico o diedral. Al repetir el mismo cálculo en la estructura cristalina resuelta de la hemoglobina, la relación entre las áreas superficiales de las formas tetraméricas y DME fue de 1,63, lo que corresponde a una simetría D dos. Obviamente, este modelo geométrico fue simplificado y las subunidades proteicas no son meramente esféricas.

Sin embargo, este cálculo demuestra el prometedor potencial que tiene la SIMM para revelar la disposición de complejos con estructuras de alta resolución desconocidas. Acabo de mostrarle cómo medir el tiempo de deriva de la proteína y de los complejos proteicos, así como cómo calcular sus valores de sección transversal de colisión. Al realizar este procedimiento, es importante adquirir los datos de SIMM para las proteínas patrón utilizando exactamente las mismas condiciones empleadas para la proteína diana o los complejos proteicos.

Además, recomendamos encarecidamente repetir al menos tres veces estos experimentos y determinar la desviación estándar de estas mediciones por triplicado. Eso es todo. Gracias por vernos y buena suerte con sus experimentos.