Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) Ensayo de interacción proteína-proteína en las células de cebolla con la pistola de genes Helios

Este procedimiento evalúa la interacción proteína-proteína in vivo entre dos reguladores transcripcionales de Arabidopsis, SEU (abreviado de seus) y LUH (abreviado de lu holog). Mediante el uso de la complementación de fluorescencia biomolecular, SEU se fusiona al fragmento terminal N del proteína fluorescente amarilla (YFP), y LUH se fusiona al fragmento terminal C del ADN-YFP. Los constructos plasmidiales Seus-NYFP y LUH-CYFP son bombardeados en células epidérmicas de cebolla para evaluar su interacción.

Una interacción entre Seuss y LUH provoca la asociación de los fragmentos terminal N y terminal C de YFP en los núcleos, lo que lleva a la fluorescencia de YFP en los núcleos. Tras una incubación de 16 a 20 horas en la oscuridad, se observan las láminas de epidermis de cebolla bajo un microscopio de fluorescencia para visualizar la fluorescencia. Hola, soy Courtney Hollander del laboratorio del Dr. Zhi Lu del Departamento de Biología Celular y Genética Molecular de la Universidad de Maryland.

Hoy les mostraremos un procedimiento para probar la interacción proteína-proteína en células de cebolla utilizando la pistola génica BioRad Helios. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para evaluar interacciones proteína-proteína y la localización de proteínas en células vegetales. Así que comencemos.

Para comenzar este procedimiento, prepare cartuchos para la pistola génica Helios siguiendo el Protocolo de Video JoVE de Woods y Zeto 2008, que demuestra en detalle el procedimiento de preparación de cartuchos para cada preparación. Cincuenta microgramos de ADN plasmídico total se mezclan con 12,5 miligramos de partículas de oro y solución de PVP al 0,5 miligramos por mililitro para BIFC. Combinando la misma preparación de cartuchos, los dos ADN plasmídicos de las proteínas en interacción putativas Seuss fusionadas a la mitad N-terminal de YFP, abreviado seus, NYFP y homólogo de LU fusionado a la mitad C-terminal de YFP, abreviado L-U-H-C-Y-F-P.

La cantidad combinada es de 50 microgramos por preparación, lo que produce hasta 50 cartuchos con un microgramo de ADN por 0,25 miligramos de oro por cartucho. Cada cartucho es para un solo disparo. Después de la preparación de los cartuchos, pruebe los cartuchos para determinar si las partículas de oro son impulsadas de manera eficiente.

Envuelva un trozo cuadrado de paraformo alrededor de una placa de Petri. Luego, ajuste la presión de helio entre 150 y 200 PSI y dispare los cartuchos recién elaborados hacia el cuadrado de paraformo. Observe partículas doradas tenues en el paraformo.

Pueden propulsarse diferentes cantidades de partículas de oro sobre el parfum a distintas presiones de helio. Sin embargo, si no hay una diferencia significativa, elija la presión más baja para el bombardeo. Esta prueba también indica el área cubierta por cada disparo.

Para preparar los tejidos de cebolla, retire la capa externa de una cebolla amarilla grande utilizando una cuchilla de afeitar limpia y afilada. Corte un área rectangular de dos por ocho centímetros, con una profundidad de cuatro a cinco capas. Extraiga el tejido rectangular de la cebolla y deseche las dos capas externas.

Corte las capas restantes de la cebolla en trozos cuadrados de aproximadamente 1,5 centímetros. Coloque los trozos de cebolla en una placa de Petri que contenga círculos de papel filtro de tres mm. Humedezca con agua estéril y tape la placa de Petri.

Las piezas de cebolla están listas para la bombardeo. Primero cargue los cartuchos en los porta-cartuchos redondos blancos; cargue cartuchos que contengan diferentes construccos de plásmidos en distintos porta-cartuchos. Cada porta-cartuchos puede contener hasta 12 cartuchos para 12 disparos.

Se cargan aquí tres portaportadores diferentes. El primer portaportadores tiene cartuchos que contienen el promotor fuerte y constitutivo 35 S-G-F-P-A del virus del mosaico de la coliflor. Este plásmido sirve como control positivo.

El segundo portador se carga con los cartuchos experimentales que contienen una cantidad igual de S-E-U-N-Y-F-P y L-U-H-C-Y-F-P. El tercer portador de cartuchos se carga con cartuchos que contienen una mezcla molar equimolar del vector de la espina del disco y la especia del disco LUH. Esto también sirve como control negativo.

Inserte la batería y el revestimiento de barril nuevo en la pistola génica Helios. Asegúrese de que tanto el revestimiento de barril como la pistola tengan sus respectivas juntas tóricas colocadas. A continuación, inserte un portador de cartuchos vacío en la pistola génica, con el número de marca 12 en el portador de cartuchos orientado hacia la parte superior de la pistola.

Avance el portacartuchos una o dos veces para asegurarse de que esté insertado correctamente. Luego, conecte la pistola al tanque de helio y ajuste la presión entre 150 y 200 PS.I. Use protección auditiva y dispare la pistola varias veces manteniendo presionado el botón lateral mientras jala del gatillo. Disparar la pistola con el portacartuchos vacío limpia la cámara de la pistola y asegura que la presión sea estable.

Antes de disparar el ADN, disparar un trozo de cebolla aquí puede servir como un control negativo para la fluorescencia de fondo. Para disparar las partículas de oro recubiertas con ADN, retire el portacartuchos vacío e inserte el primer portacartuchos cargado que contiene el control positivo. Avance el portacartuchos para que el cartucho destinado a disparar se coloque en la parte inferior del portacartuchos.

Ahora coloque trozos de cebolla en el centro de una placa de Petri vacía, con la capa más interna de la cebolla orientada hacia arriba. Apoye el revestimiento del cañón del cañón genético sobre la placa de Petri y dispare el arma. Pase al siguiente cartucho y dispare a un trozo diferente de cebolla.

Repita este paso hasta que se disparen cuatro o cinco trozos de cebolla. Cada trozo de cebolla se dispara solo una vez después del disparo. Transfiera el trozo de cebolla bombardeado a una placa de Petri que contenga papel de filtro húmedo de tres mm para disparar los cartuchos experimentales.

Cambie al cartucho Holden. Número dos, recuerde cambiar el revestimiento del barril para prevenir contaminación. Dispare cuatro o cinco trozos de cebolla como se acaba de mostrar para el control positivo.

Luego cambie al cartucho Holden número tres, que contiene el ADN de control negativo. Y nuevamente, dispare cuatro a cinco trozos de cebolla.

Cambie el revestimiento del barril para evitar la contaminación. Después de la bombardeo, cubra las placas de Petri que contienen los trozos de cebolla con sus tapas.

Envuélvalos con paraformo para evitar que se sequen. Incube los trozos de cebolla a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 16 a 48 horas. Una vez finalizada la bombardeo, apague el gas y libere la presión antes de desconectar la pistola génica del tanque de helio, desenrosque el forro del cañón y retire el portador de cartuchos y los cartuchos usados.

Finalmente, limpie los portacartuchos y los revestimientos del barril sumergiéndolos en un vaso de precipitados con agua jabonosa y sometiéndolos a ultrasonidos durante 20 minutos. Posteriormente, enjuáguelos con agua para eliminar todos los residuos de jabón.

Sumérjalo en etanol al 70 % durante una hora y luego séquelo sobre toallas de papel. Proceda a observar los trozos de cebolla entre 16 y 20 horas después de la bombardeo. Después de incubar los trozos de cebolla bombardeados entre 16 y 20 horas a temperatura ambiente, use pinzas con extremos planos para pelar lentamente una sola capa celular del epitelio interno de la cebolla.

Esta es la capa que enfrenta directamente el cañón durante el bombardeo. Coloque la capa pelada sobre una gota de agua en una cubierta de portaobjetos con un cubreobjetos. Pero tenga cuidado de minimizar las burbujas.

Observe la fluorescencia de GFP o YFP utilizando un microscopio de fluorescencia como el zeiss axio observer, punto Z uno mostrado aquí bajo el campo brillante del microscopio. Primero verifique el flujo citoplasmático para asegurarse de que las células estén vivas. Para hacerlo.

Exponga el portaobjetos a la luz de campo brillante durante unos minutos para calentar el tejido de cebolla y luego busque el movimiento del citoplasma. La corriente citoplasmática no siempre es fácil de observar, así que no se desanime si no es claramente visible. Para la detección de fluorescencia, utilice los filtros de excitación y detección adecuados para GFP o YFP. También revise los controles negativos, que son los trozos de cebolla transformados con un plásmido no fluorescente.

Pueden aparecer señales amarillas tenues procedentes de células dañadas, restos y cebollas. Asimismo, revise los controles positivos. El plásmido contiene un reportero fluorescente expresado constitutivamente.

Se observa fluorescencia GFP en algunas, pero no en todas las células. Las burbujas de aire también pueden producir fluorescencia de fondo. Las señales GFP visibles en las células epidérmicas de cebolla indican que los cartuchos, los tejidos de cebolla y el disparo del genióforo están adecuadamente preparados y ejecutados.

Se muestra aquí la intensa fluorescencia observada a partir del plásmido positivo para SGFP 35. La intensa fluorescencia se observa en toda la célula, incluyendo tanto el núcleo como el citoplasma. La imagen de campo claro permite ver el contorno correspondiente de las células y los núcleos.

No todas las células se transforman. La señal fluorescente de YFP se detecta en el núcleo de la célula de cebolla cuando la combinación experimental Seuss, NYFP y L-U-H-C-Y-F-P se bombardea en células de cebolla, lo que indica que Seuss, NYFP y L-U-H-C-Y-F-P interactúan in vivo. Sin embargo, esta fluorescencia mediada por la interacción es significativamente más débil que la fluorescencia mediada por 35 SGFP en el control positivo.

Además, los factores de transcripción SEUS y LUH se localizan en los núcleos. Por lo tanto, la fluorescencia de YFP solo se observa en el núcleo. Asimismo, el número de células fluorescentes es significativamente menor que el del control positivo 35 SGFP.

Esto se debe a que B FFC solo funciona cuando ambos plásmidos asociados se expresan en las mismas células de cebolla. No se detecta señal fluorescente en cebollas bombardeadas con el portador de cartucho número tres, que contiene una mezcla de puck spine, vector y L-U-H-C-Y-F-P, tal como se espera del control negativo. Acabamos de mostrarle cómo bombardear células de cebolla para probar interacciones proteína-proteína utilizando el sistema de pistola génica BioRad Helios.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar el uso de controles positivos y negativos adecuados y tener en cuenta que la fluorescencia del BIFC puede ser más débil en intensidad y menor en número de células fluorescentes. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.