Fluorescencia de Complementación bimolecular

Este experimento tiene como objetivo determinar si dos proteínas interactúan en células y definir aspectos de los sitios de dicha interacción. Primero, las células se transfectan con constructos de expresión que codifican las dos proteínas de interés, una de las cuales se fusiona al extremo terminal de una proteína fluorescente fragmentada y la otra se fusiona al extremo C complementario de la proteína fluorescente fragmentada. Después de permitir que las células transfectadas desarrollen la señal fluorescente en cultivo, los complejos proteicos se visualizan mediante imágenes y inmunotransferencia.

A continuación, las imágenes recopiladas se exportan a software de análisis de imágenes, como Image J, con el fin de cuantificar la intensidad media de fluorescencia por célula. En un experimento controlado, los resultados de BIFC pueden demostrar interacciones proteína-proteína y la localización de estos complejos, como los dominios SH tres de la proteína de andamiaje intersectina y el dominio rico en prolina de PI tres KC dos beta. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la colocalización, la inmunoprecipitación y el FRET, es que BIFC permite la localización espacial de interacciones débiles y transitorias dentro de la célula. Además, este método no requiere un procesamiento extenso de las imágenes posteriores, como ocurre con el FRET.

Este método puede abordar preguntas clave en el área de la transducción de señales, como si las proteínas X e Y interactúan, y en caso afirmativo, cuáles son los compartimentos específicos a los que se localizan estos complejos en la célula. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no han elegido la configuración adecuada para expresar su biopsia. Proteínas diana marcadas Comience seleccionando uno de los múltiples fluoróforos para las proteínas de fusión BIFC.

Considere que los extremos amino y carboxilo de Venus son capaces de formar un complejo a 37 grados Celsius, mientras que los fragmentos Y-F-P-B-I-F-C requieren una preincubación a 30 grados Celsius. Diseñe vectores de expresión para la adición de etiquetas a las proteínas de interés considerando cómo la unión de los fragmentos BIFC podría afectar la función de las proteínas de interés. Por ejemplo, la familia de las RAs, las GTP asas están modificadas por lípidos en el extremo carboxilo y no pueden etiquetarse en este extremo sin interrumpir dicha modificación.

Realice siempre experimentos piloto para determinar las condiciones de transfección. Además, supervise las células mediante microscopía de fluorescencia para identificar un momento óptimo para el desarrollo de la señal. Luego, realice un análisis western blot para confirmar la expresión equitativa de los constructos.

Es importante realizar una inmunotinción para la etiqueta HA o flag para verificar que la adición de los fragmentos BIFC no altere la localización celular de las proteínas de interés en cada placa de muestra. Inocular 1,3 × 10⁵ células en cada una de las placas con fondo de vidrio y en dos pocillos de una placa de seis pocillos y dejar que las células se asienten durante la noche en un incubador a 37 grados Celsius. Al día siguiente, preparar el ADN para la transfección mediante lipofección o cualquier otro método preferido.

Primero, diluya el ADN en 250 microlitros de DMEM sin suero como control de transfección. Añada CFP en una relación de uno a cincuenta, respecto a la cantidad total de ADNs BIFC. Ahora, diluya el lip en 250 microlitros de DMEM sin suero, utilizando 10 microlitros de lip por cada microgramo de ADN.

Mezcle las diluciones de ADN y lip, incube a temperatura ambiente durante 20 minutos. Enjuague las células dos veces con DMEM sin suero tibio. Añada dos mililitros de DMEM sin suero a cada placa con fondo de vidrio o pocillo de una placa de seis pocillos.

Luego, divida cada mezcla de transfección por igual entre un platillo con fondo de vidrio y dos pocillos de una placa de seis pocillos; incube las células a 37 grados Celsius durante cinco horas. Finalmente, retire el medio de transfección y sustitúyalo por medio DMEM completo más medio con 10 % de FBS.

Incube las células durante el tiempo determinado en experimentos piloto para obtener los niveles necesarios de expresión de las proteínas de interés. Examine las células transfectadas bajo un microscopio epifluorescente para asegurarse de que el control positivo sea fluorescente. Enjuague las células tres veces con PBS para la obtención de imágenes de células vivas.

Coloque las células en medio sin colorantes indicadores. Para la obtención de imágenes de células fijadas, agregue paraformaldehído al 2 % y coloque en hielo durante 10 minutos.

Luego, lave las células tres veces con PBS, ahora cubierto con un mililitro de PBS, y almacénelo en la oscuridad a cuatro grados Celsius; lise inmediatamente las células en la placa de seis pocillos. Para los análisis de inmunotransferencia, es importante que todas las células se preparen al mismo tiempo, de modo que las células lisadas sean representativas de las células de la imagen. Realice una inmunotransferencia para asegurar que las proteínas marcadas se expresen a niveles equivalentes.

Al obtener imágenes de células con un microscopio confocal, es importante mantener constantes los ajustes durante todo el experimento para que la fluorescencia sea comparable entre muestras. Asegúrese de obtener imágenes de células individuales en las que los píxeles no estén saturados. Dado que se incluyó CFP como control de transfección, seleccione únicamente células positivas para CFP para el análisis de las señales BIFC.

Cuantifique la fluorescencia utilizando un software de imágenes como ImageJ. Abra los archivos de imagen en ImageJ. Vaya a Analizar y establezca las mediciones. Marque las casillas de área y valor medio de escala de grises en el cuadro de mediciones. Tenga en cuenta que, en este ejemplo, las imágenes venosas se han coloreado artificialmente de verde y las imágenes de CFP, de rojo.

Utilizando la herramienta de selección a mano alzada, dibuje un contorno alrededor del borde de toda la célula en el canal CFP, dejando este contorno en su lugar. Cambie al canal YFP. Vaya a analizar y mida el valor medio de gris, que refleja la intensidad media de fluorescencia por célula para cada imagen.

Dibuje un círculo en el canal YFP en un área que no contenga una célula. Tome una medición de esta área como fondo. Reste el fondo de cada imagen.

Finalmente, para calcular la intensidad media de fluorescencia en una población de células, promedie el valor medio del grado menos el fondo para todas las células capturadas en una muestra. Idealmente, cuantifique 60 células a lo largo de tres experimentos. La proteína de andamiaje multifuncional intersectina regula la supervivencia neuronal mediante la regulación de una nueva clase dos de fosfatidilinositol tres quinasa, PI3K-C2β. Los dominios SH3 de intersectina interactúan con la región rica en prolina del extremo amino terminal de PI3K-C2β. La transfección de intersectina marcada con VN junto con PI3K-C2β marcada con VC da como resultado una señal fluorescente en el canal YFP, que se colorea artificialmente de verde, indicando la formación del complejo.

El CFP, pseudocoloreado aquí en rojo, se utiliza como control para marcar las células transfectadas. Las mutaciones en el dominio rico en prolina de PI tres KC dos beta, que interrumpen la coprecipitación de intersectina y PI tres KC dos beta, reducen la señal de BIFC. Esta diferencia en la señal de BIFC no se debe a diferencias en la expresión de las proteínas de tipo silvestre y PA PI tres K. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres días si se lleva a cabo correctamente. Al realizar este procedimiento, debe recordar ejecutar los controles adecuados y verificar la expresión de las proteínas para asegurarse de que las diferencias en la señal de BC se deban a diferencias en la formación del complejo y no a la expresión tras seguir este procedimiento.

Otras técnicas, como el plasma de superficie en residentes, se pueden realizar para responder preguntas como: ¿cuáles son las diferentes afinidades de estos complejos entre sí?