Electrofusión de células visualiza con microscopía de fluorescencia
1 de julio de 2010
En este video se demuestra electrofusión eficiente de las células In vitro Por el método de adhesión modificar mediante electroporación y la posterior detección de la visualización de células fusionadas con microscopía de fluorescencia.
La electrofusión implica la aplicación de pulsos eléctricos breves de alto voltaje a células en estrecho contacto. En este video, demostramos la electrofusión de células in vitro mediante el método de Adherencia modificado. Los experimentos se realizaron con células de melanoma de ratón, BF uno.
Para el experimento, siga estos pasos. Cultive células en dos frascos de cultivo separados hasta alcanzar una confluencia del 80 %. Por separado, agregue 2,1 µL de cada solución stock.
10 milimolar de C-M-F-D-A o CMRA, respectivamente, a tres mililitros de tampón Krebs Hess en un tubo de centrífuga. Lave las células dos veces con tampón Krebs Hess y luego introduzca las soluciones de carga en los frascos. Las soluciones de carga contienen aproximadamente siete micromolar de C-M-F-D-A o CMRA, respectivamente.
Incube las células durante 30 minutos en una atmósfera controlada. Durante esta primera incubación, las regiones pasan libremente a través de las membranas celulares hacia el citosol, donde se transforman en productos de reacción permeables a la membrana IMP. Después de esta primera incubación, enjuague y luego incube las células con medio de cultivo durante otras dos horas.
Las células se observan utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara CCD refrigerada en el software de adquisición. Establezca la longitud de onda de excitación en 548 nanómetros y seleccione un filtro de paso de banda adecuado para obtener la imagen de fluorescencia de las células cargadas con CMRA para las células cargadas con C-M-F-D-A. Establezca la longitud de onda de excitación en 492 nanómetros y elija un filtro de paso de banda para la imagen de fluorescencia verde de los ojos de tripsina, cuente las células en ambos frascos y mezcle las células rojas y verdes juntas en una proporción de uno a uno; ajuste la concentración celular a 5 millones de células por mililitro.
Coloque una gota de 20 microlitros de suspensión celular en el centro de cada pocillo. Incube las células en una placa de 24 pocillos en una atmósfera controlada durante 20 minutos para permitir que las células se adhieran ligeramente a la superficie del pocillo en una monocapa y establezcan contactos celulares entre sí. Coloque la placa de pocillos con las células sobre la platina del microscopio.
Coloque los electrodos en la parte inferior del pocillo y conéctelos al generador de pulsos. Para lograr una electrofusión óptima y mantener la viabilidad celular, deben utilizarse parámetros adecuados de pulsos eléctricos. Estos parámetros dependen de la línea celular y deben determinarse en experimentos preliminares. Retire el medio de cultivo y lave las células con un mililitro de tampón fosfato de potasio ISO omu con 350 microlitros de tampón fosfato de potasio hypos Miller para inducir la hinchazón celular.
Deje las células en tampón hiperosmótico durante dos minutos antes de aplicar los pulsos eléctricos. Los pulsos eléctricos deben aplicarse cuando las células estén cerca de sus volúmenes máximos, es decir, antes de que comiencen la regulación del volumen.
Disminución en nuestro experimento. Se aplicó un tren de ocho pulsos rectangulares con una duración de 100 microsegundos a un hercio. Después de la entrega del pulso.
Deje las células sin perturbar durante 10 minutos tras 10 minutos. Determine el rendimiento de difusión mediante microscopía de contraste de fase y fluorescencia. Adquiera tres imágenes, de contraste de fase, fluorescencia roja y verde, en cinco campos de visión elegidos al azar.
En cada uno, se crearán imágenes de tres canales a partir de cada tríada de imágenes en el software ImageJ para mejorar la calidad visual de las imágenes antes de que se puedan aplicar pasos de preprocesamiento a las imágenes originales, como la sustracción de fondo y mejoras de contraste con conjuntos de parámetros predeterminados. Finalmente, las imágenes de tres canales se componen utilizando el complemento RGB a escala de grises de ImageJ. En dicha imagen, se puede observar el citoplasma en reposo junto con las membranas celulares.
Por lo tanto, pocos pueden determinarse fácilmente en la imagen de tres canales que contabiliza los tres tipos de células: rojas, verdes y doblemente fluorescentes. Determine el porcentaje de células doblemente fluorescentes dividiendo el número de células doblemente fluorescentes entre el número total de células en cada imagen. El rendimiento de fusión se define entonces como el porcentaje de células doblemente fluorescentes multiplicado por dos.
Dado que la mitad de las células de vista no se detectan cuando las células tienen vistas del mismo color.
Descripción general
Este video demuestra la electrofusión eficiente de células in vitro mediante un método de adhesión modificado combinado con electrotransferencia. El proceso incluye la detección de células fusionadas mediante microscopía de fluorescencia.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Técnicas de fusión celular
- Métodos de electropermeabilización
- Aplicaciones de microscopía de fluorescencia
Antecedentes
- La electrofusión es una técnica que aplica pulsos eléctricos para facilitar la fusión celular.
- Este método puede aumentar la eficiencia en la creación de células híbridas.
- La microscopía de fluorescencia permite la visualización de células fusionadas.
- Comprender la fusión celular es fundamental para diversas aplicaciones biológicas.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método confiable para la electrofusión de células.
- Visualizar y cuantificar la eficiencia de la fusión celular.
- Proporcionar un protocolo que pueda replicarse en otros laboratorios.
Métodos Utilizados
- Las células de melanoma de ratón se cultivaron y prepararon para la fusión.
- Se utilizaron colorantes fluorescentes para marcar las células antes de la fusión.
- Se aplicaron pulsos eléctricos para inducir la fusión celular.
- Se empleó microscopía de fluorescencia para analizar los resultados de la fusión.
Resultados principales
- Se logró con éxito la fusión de células, tal como lo indicó la fluorescencia.
- Se calculó el porcentaje de células doblemente fluorescentes para determinar el rendimiento de fusión.
- Se identificaron los parámetros óptimos del pulso eléctrico para la viabilidad celular.
- La calidad visual de las imágenes se mejoró mediante técnicas de procesamiento de imágenes.
Conclusiones
- El método de adhesión modificado es efectivo para la electrofusión celular.
- La microscopía de fluorescencia es una herramienta valiosa para evaluar la eficiencia de fusión.
- Este protocolo puede adaptarse para diversos tipos celulares en la investigación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La electrofusión celular visualizada mediante microscopía de fluorescencia proporciona una plataforma no viral y no química para generar células híbridas, apoyando la investigación temprana en biofármacos. La visualización cuantitativa de los eventos de fusión permite una evaluación rigurosa de las técnicas de manipulación celular, afectando directamente la validación de objetivos y el desarrollo de ensayos. Este enfoque fortalece la confianza predictiva en los flujos de trabajo basados en células e informa las decisiones de cartera ajustadas al riesgo.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de los mecanismos de fusión celular relevantes para la comprobación de hipótesis terapéuticas.
- Apoya la validación funcional de estrategias de manipulación celular para la generación de células híbridas.
- Facilita la reducción de riesgos biológicos mediante la cuantificación de la eficiencia y especificidad de la fusión.
- Proporciona resultados cuantificables para la selección de carteras y la confianza en los objetivos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Establece sistemas celulares validados para el cribado posterior de fenotipos dependientes de la fusión.
- Proporciona una cuantificación estandarizada y reproducible del rendimiento de fusión mediante doble fluorescencia.
- Permite la escalabilidad del ensayo y la reutilización de la plataforma para la evaluación de compuestos dirigidos a procesos de fusión celular.
- Facilita la comparación fiable de protocolos de fusión entre diferentes tipos celulares.
Investigación Translacional y Preclínica
- Se alinea con los flujos de trabajo traslacionales al permitir la generación de células híbridas para la modelización preclínica.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de terapias basadas en células.
- Reduce la ambigüedad mecanicista en las estrategias de manipulación celular para el desarrollo terapéutico.
- Apoya el avance ajustado al riesgo de conceptos terapéuticos basados en la fusión celular.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al permitir la cuantificación y visualización robustas de la fusión celular, apoyando tanto la validación temprana como la investigación traslacional.
- Biología de Descubrimiento: La medición cuantitativa del rendimiento de fusión apoya la formulación de hipótesis y la aclaración de vías.
- Selección: Los detectores de doble fluorescencia permiten el desarrollo de ensayos reproducibles y su comparación de referencia.
- Análisis: La cuantificación basada en imágenes proporciona resultados objetivos y comparables para la evaluación de condiciones.
- Investigación Traducional: La generación de células híbridas posibilita la modelización preclínica y la alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: El flujo de trabajo es adaptable entre tipos celulares y programas de investigación, mejorando el valor de la plataforma.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los protocolos de fusión celular.
- Valor operativo: Estandariza la cuantificación de la fusión y favorece la reproducibilidad entre diferentes equipos.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar proyectos y mejora la eficiencia del capital en programas de fase inicial.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de estrategias terapéuticas basadas en células.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular, microscopía de fluorescencia y análisis de imágenes.
- Necesita acceso a generadores de pulsos, microscopios de fluorescencia y software de procesamiento de imágenes.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de marcado, adquisición de imágenes y cuantificación.
- La adaptación entre líneas celulares puede requerir la optimización de los parámetros del pulso y las condiciones de marcado.
- La eficiencia de fusión y la viabilidad dependen de la línea celular y deben determinarse empíricamente.
