Luz correlativa y Microscopía Electrónica (CLEM) como una herramienta para visualizar moléculas microinyección y sus objetivos eucariotas subcelulares

El objetivo general del siguiente experimento consiste en introducir moléculas pequeñas o proteínas marcadas con fluorescencia en el citoplasma de una célula mamífera en cultivo, y observar los cambios morfológicos inducidos con una resolución que va desde el micrómetro hasta varios nanómetros. Esto se logra primero cultivando células mamíferas sobre cubreobjetos de vidrio con rejilla e inyectando mediante microinyección una molécula pequeña o proteína de interés marcada con fluorescencia. A continuación, las células se fijan con formaldehído y se observan e imaginan mediante microscopía de fluorescencia.

Luego, las células se fijan con glutaraldehído, se seccionan, se tiñen y se imagan mediante microscopía electrónica. Finalmente, las imágenes obtenidas durante la microscopía electrónica y la microscopía fluorescente de campo claro se combinan y alinean. En última instancia, la correlación de estas imágenes permite al investigador obtener imágenes con alta resolución de las perturbaciones inducidas por la molécula pequeña o la proteína de interés.

Hola, soy el Dr. Evan Reddick en el laboratorio del Dr. Neil Alto, del departamento de microbiología del Centro Médico de la Universidad del Suroeste de Texas en Dallas. Hoy les hablaré sobre el procedimiento M Clem, o microinyección con microscopía correlativa de luz y electrones. La principal ventaja de este procedimiento frente a técnicas independientes, como la microinyección o la microscopía por separado, es que aquí se realizan conjuntamente y se facilitan mediante el uso de una cubreobjetivo de vidrio con rejilla.

Es este cubreobjetos cuadriculado el que permite a los investigadores regresar a la misma célula durante diferentes partes del protocolo. Además, esta técnica ofrece al investigador la posibilidad de observar cambios arquitectónicos subcelulares inducidos por una amplia variedad de moléculas pequeñas inyectables o proteínas de interés, y hacerlo con una resolución que va desde el orden de micrómetros hasta varios nanómetros. Para prepararse para la microinyección, cultive células, como células de riñón de rata normal o células de cáncer cervical inmortalizadas, sobre cubreobjetos de vidrio cuadriculados con grabado fotolitográfico fijados a placas para células vivas, e incube las células a 37 grados Celsius y 5 %CO2.

Dependiendo de la cronología experimental que se vaya a utilizar, ajuste la confluencia de las células. Una placa completamente confluente hará muy difícil la identificación de las células microinyectadas en el microscopio electrónico. Por lo tanto, siembre las células de manera que alcancen aproximadamente una confluencia del 50 % el día del experimento corto y alrededor del 25 % de confluencia.

En el día de un experimento más largo, prepare proteínas marcadas con fluorescencia, ADN u moléculas pequeñas en el tampón adecuado hasta un volumen final de 50 microlitros. Dependiendo del fluoróforo elegido, agregue un colorante marcador como rojo Texas o azul cascade. Añada una concentración de 0,5 a un miligramo por mililitro.

Filtre la solución a través de un filtro centrífugo de 0,22 micrones. Después de preparar las agujas para microinyección siguiendo las instrucciones del fabricante, pipetee cuidadosamente microlitros de solución hacia la parte trasera de una aguja. Coloque la aguja en el brazo del micromanipulador de un dispositivo comercial de microinyección acoplado a un microscopio invertido.

Coloque un cultivo celular en un recipiente dentro del soporte del microscopio invertido. Localice las células que crecen dentro de una cuadrícula fotograbada y anote el identificador alfanumérico de la cuadrícula. Este se utilizará en todos los pasos posteriores.

Es importante elegir células para microinyección que estén adheridas cerca del centro del cubreobjetos, y evitar aquellas cercanas a la periferia. Esto es fundamental porque garantizará una transferencia eficiente de sus células de interés al centrador de resina epoxi que se utilizará posteriormente para microscopía electrónica. Baje manualmente el brazo de inyección sobre el cubreobjetos y use el micromanipulador para bajar la aguja hasta que la punta toque suavemente la superficie de las células. Microinyecte una de cada dos células dentro de la cuadrícula seleccionada; para células cultivadas con una confluencia de aproximadamente el 50 %, espere alrededor de 80 células por cuadrícula de 600 micrómetros cuadrados, lo que dará un valor de N de aproximadamente 30 a 40 células experimentales y controladas.

Después de la inyección, coloque la placa nuevamente en el incubador durante un tiempo determinado para realizar microscopía fluorescente. Deseche el medio de crecimiento y fije las células con formaldehído en PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos. Reemplace el fijador con un XPBS.

Luego, documente la disposición de las células tomando de cinco a diez imágenes de campo brillante de la cuadrícula seleccionada con aumento bajo y alto. Para identificar las células microinyectadas, tome imágenes fluorescentes a las longitudes de onda de excitación y emisión del colorante inerte de inyección eye. Utilizando un microscopio confocal, recolecte un Zack de imágenes de células microinyectadas con alto aumento dentro de la misma cuadrícula previamente analizada.

Se necesita una ampliación alta para correlacionar las imágenes fluorescentes con las estructuras subcelulares que se identificarán mediante microscopía electrónica. Después de la imagen confocal, utilice un líquido para la remoción de cubreobjetos para separar el cubreobjetos del recipiente y colóquelo con la cara de las células hacia arriba en un nuevo recipiente de cultivo que contenga un XPBS. Continúe con el procesamiento para microscopía electrónica.

Siga los protocolos estándar de microscopía electrónica. Para fijar, teñir y deshidratar las muestras, prepare resina de epon y coloque la laminilla con la cara celular hacia abajo sobre un tubo lleno de resina de epon. Deje que la resina polimerice a 60 grados Celsius durante 24 horas.

Para retirar la cubreobjetos de la resina de epon, sumérjala rápidamente en nitrógeno líquido. El choque térmico de 60 grados Celsius a menos 196 grados Celsius.

Desprende el cubreobjetos del tubo de resina. Espere de cinco a diez minutos, luego recupere el tubo, que ahora está libre del cubreobjetos. Bajo un microscopio estereoscópico, inspeccione la superficie de la resina para localizar la cuadrícula de interés.

Utilizando una cuchilla de afeitar estéril o un escalpelo, recorte el bloque de epoxi de manera que solo la cuadrícula de interés quede en el ápice del bloque; corte secciones seriadas del bloque recortado con un ultramicrótomo. Contraste las secciones utilizando acetato de uranilo y citrato de plomo siguiendo protocolos estándar. Vuelva a localizar las células deseadas en el microscopio electrónico utilizando la posición relativa de las células como guía, empleando las imágenes fluorescentes de alta resolución capturadas previamente.

Identifique regiones de interés en el micrografiado electrónico que correspondan a la señal fluorescente. Utilice puntos de referencia como la posición de la heterocromatina y el envoltorio nuclear para determinar qué imagen fluorescente de Zack corresponde al corte de ME. Con un programa de imágenes como Image J o Adobe Photoshop, reduzca la opacidad de la imagen fluorescente al 50 % y superponga esta sobre la imagen de MET correspondiente.

Alinee las imágenes ajustando la escala mostrada. A continuación se presentan los resultados de la microinyección y la microscopía correlativa de luz y electrones. Esta imagen muestra el micrografía de campo claro de células NRK creciendo sobre un cubreobjetos con rejilla de vidrio grabado con láser.

Ténganse en cuenta las letras de fondo b y m utilizadas para identificar la cuadrícula que contiene las células inyectadas. Las flechas indican las dos células identificadas e imágenes mediante microscopía electrónica. Aquí se muestra una imagen fluorescente del colorante trazador inerte azul de cascadilla utilizado para identificar las células microinyectadas.

Aquí se muestra una superposición de las señales de campo brillante y fluorescencia de una molécula pequeña etiquetada con aminas. Este panel representa la correlación entre microscopía óptica fluorescente y microscopía electrónica de una célula inyectada. La punta de flecha indica puntos fluorescentes captados con mayor aumento en este panel.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo microinyectar una proteína de interés y rastrear los cambios morfológicos subcelulares que induce, utilizando el procedimiento de microinyección Clem o microscopía correlativa de luz y electrones.