Patrón fotoestimulación con dispositivos digitales de Micromirror encargado de investigar la integración a través de puntos dendríticas Poder

El objetivo general de este procedimiento es controlar patrones complejos de luz en el tiempo y el espacio para que puedan utilizarse en la estimulación de neuronas. Esto se logra primero colocando un chip DMD en un plano de imagen conjugado adecuado dentro del trayecto óptico del microscopio. El segundo paso del procedimiento consiste en iluminar correctamente el DMD con una fuente de luz intensa, como un láser.

El tercer paso del procedimiento consiste en eliminar el efecto de moteado de la iluminación coherente. El paso final del procedimiento es integrar una interfaz gráfica de usuario para manipular el chip DMD. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que experimentos que anteriormente eran difíciles de realizar ahora pueden completarse relativamente con facilidad mediante la lisis en múltiples sitios del neurotransmisor enjaulado empleando el sistema DMD.

Hola, soy Michael Mohammed y del laboratorio del Dr. Chaman Tang en el Departamento de Neurología de la Universidad de Maryland. Hoy les mostraremos un procedimiento para generar patrones complejos de eliminación en un microscopio óptico. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la integración dendrítica.

Entonces, comencemos. Este protocolo demostrará el funcionamiento de un dispositivo digital de microespejos o sistema de iluminación DMD para la neurociencia experimental. Un DMD es un chip semiconductor óptico con varios cientos de miles de microespejos móviles dispuestos en una matriz rectangular; en su superficie, la posición de cada espejo corresponde al píxel de una imagen.

Cada espejo puede controlarse individualmente para inclinarse entre dos orientaciones. En la orientación apagada, la luz se dirige lejos del eje óptico de la iluminación del espécimen. En la orientación encendida, la luz se dirige a lo largo del eje óptico.

El DMD es muy adecuado para la lisis porque tolera luz UV muy intensa, genera altas relaciones de contraste entre los píxeles encendidos y apagados y puede cambiar entre ambos estados en decenas de microsegundos. La aplicación de los DMD en la investigación biomédica se ve favorecida por el amplio uso de software y hardware para la manipulación de imágenes, así como por el interés comercial en el campo de la visualización de imágenes. Componentes modulares son comercializados por Texas Instruments como kits de descubrimiento DLP, que proporcionan los controladores electrónicos necesarios para adaptar el DMD a un sistema microscópico.

Es necesario comprender los conceptos básicos sobre la óptica de la microscopía. El microscopio fluorescente moderno básico consta de una trayectoria de formación de imágenes y una trayectoria de iluminación. Está compuesto por un objetivo, un cubo de filtros y dos lentes tubulares distintos para las trayectorias de formación de imágenes y de iluminación.

El microscopio está diseñado para tener posiciones conjugadas con el plano de imagen del espécimen, de modo que los objetos enfocados en el plano del espécimen también aparecerán enfocados en estos planos imagen conjugados. Una consecuencia de este concepto es que cualquier imagen brillante creada en el plano imagen conjugado también se proyectará nítidamente sobre el plano imagen del espécimen. Esta estrategia se utiliza para proyectar un patrón de iluminación generado por computadora sobre el espécimen.

El haz láser sirve como una fuente de luz muy brillante que iluminará el patrón implementado por los microespejos en los chips DMD posicionados en un plano de imagen conjugado. El diseño de un sistema de iluminación DMD depende de las luces de excitación utilizadas en experimentos de optogenética, que emplean luz en la longitud de onda visible. El patrón iluminado puede dirigirse a través de la trayectoria de la cámara.

Por lo tanto, el chip DMD simplemente puede montarse en uno de los dos puertos de cámara de un módulo con puertos duales para cámara. Por el contrario, en experimentos que utilizan luz en el rango UV, como la lisis de compuestos encarcelados, la luz debe dirigirse a través de la trayectoria de iluminación epifluorescente y debe crearse un plano de imagen conjugado más accesible. Esto se debe a que la lente tubular de imagen no está diseñada para la transmisión de luz UV.

En cambio, se utiliza la lente del tubo de iluminación para la transmisión de UV y realiza una labor adecuada en la formación de imágenes. Cada microespejo del DMD puede cambiar entre una inclinación positiva y negativa de 12 grados con respecto al plano del chip. Dependiendo de la entrada digital que recibe desde la computadora, el eje de rotación se encuentra a lo largo de las esquinas diagonales de cada espejo, a 45 grados respecto a los lados rectangulares del chip.

La orientación del ángulo del espejo está designada por un triángulo de color dorado en una esquina de la superficie frontal del chip. El ángulo del microespejo determina la alineación del ángulo de elevación (pitch) y el azimut del haz de iluminación entrante. Para iluminar el DMD, primero configure el ángulo de elevación del haz de iluminación a 24 grados respecto al eje perpendicular del chip DMD y ajuste el azimut para que sea perpendicular al eje de rotación del espejo.

El alineamiento preciso del haz es fundamental para un funcionamiento eficiente. Para experimentos de lisis, utilice una fuente láser para generar el haz de alta intensidad enfocable necesario para la liberación rápida.

Aquí se emplea un láser de estado sólido bombeado por diodo cuasi continuo y triplicado en frecuencia de ND, utilice un láser de potencia relativamente alta porque solo una pequeña fracción de la salida del láser se entrega realmente al espécimen. Al utilizar un sistema DMD, dirija la salida del láser hacia una fibra multimodo para que pueda posicionarse y orientarse fácilmente a lo largo del eje correcto para iluminar el DMD, proporcionando así una solución al problema de granulado generado por la iluminación coherente, transmitiendo la luz a través de la fibra óptica.

La fibra se enrolla alrededor de un estirador eléctrico de fibra pazo que se impulsa para hacerla oscilar alrededor de 40 kilohercios. El estiramiento microscópico de la fibra es suficiente para mover el patrón de speckle muchas veces durante la duración de cada pulso de estimulación fotónica, que es de un milisegundo, eliminando así efectivamente el efecto de speckle. Finalmente, la salida de la fibra óptica se colima mediante un objetivo microscópico UV para iluminar los DMD, y se realiza la coregistración del píxel del CCD con el software de imagen de DMD, que correlaciona espejos individuales del DMD con píxeles específicos de la cámara CCD de imagen.

La interfaz gráfica de usuario dentro del software permite al usuario asignar la orientación del espejo DMD que corresponde a la región de la imagen CCD utilizando el ratón de la computadora mediante la interfaz gráfica de usuario. Etiquete la ubicación para la estimulación óptica moviendo el cursor sobre la imagen mostrada en la pantalla de la computadora y haga clic en la región de interés etiquetada para programar el patrón de entrega de luz. El patrón marcado en la pantalla de la computadora como una serie de imágenes separadas programa el momento de los pulsos láser para cada patrón espacial en el software.

Esto se integrará con el programa de adquisición de datos P clamp. Finalmente, utilice el programa de adquisición de datos para coordinar el sincronización de la electrónica del DMD, la compuerta del láser y la adquisición de la señal eléctrica registrada mediante parche del neuronio diana. Aquí se muestra una calibración de la resolución del sistema óptico.

El tamaño mínimo del punto se muestra tal como se midió a partir de un objetivo fluorescente. La resolución fisiológica efectiva se mide mediante la amplitud del flujo de corriente en función de la estimulación fotónica. Aquí, la posición del punto, el glutamato encage fue fotolizado adyacente a una rama dendrítica de dos micrómetros de diámetro.

A medida que se movía la mancha ortogonalmente a través del sitio, se ilustran las respuestas eléctricas a la estimulación luminosa de diferentes intensidades. Se muestran las respuestas en condición de voltaje fijo en función de la intensidad de la luz.

La estimulación dendrítica distribuida puede implementarse fácilmente utilizando un sistema basado en DMD. Aquí, la intensidad de entrada se varió aumentando el número de puntos de estimulación fotosensible marcados como círculos en las dos ramas dendríticas. La sumación espacial puede ser no lineal a través de los puntos de ramificación.

Se vuelve cada vez más superlineal con el aumento de las amplitudes de entrada que llegan a las dos ramas del doble acceso. Estos resultados ilustran claramente la forma no lineal de la sumación en los puntos de bifurcación dendríticos. La superlinealidad está mediada principalmente por los receptores NMDA y no por los canales activados por voltaje.

Esto puede demostrarse mediante la aplicación de dos antagonistas del NMDA, PV y MK-801, que eliminan en gran medida el comportamiento no lineal. Acabamos de mostrarle el diseño y funcionamiento básicos de un sistema basado en DMD para la estimulación fotoestimulación con patrones de tejido neural. El sistema puede adaptarse para estimulación con luz visible, como la utilizada en experimentos de optogenética.

También puede ser adaptativo para luces de luz ultravioleta cercana, como las utilizadas en la lisis por un solo fotón. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que si se va a utilizar una luz con una longitud de onda menor a 400 nanómetros y la mayoría de las personas la dirigen a través de la trayectoria de iluminación epifluorescente, el alineamiento preciso del haz de iluminación dentro de unos pocos grados es fundamental, y que si se utiliza una luz coherente, debe eliminarse eficazmente el efecto de moteado. Eso es todo.

Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.