Un enfoque de genética inversa para probar la redundancia funcional durante la embriogénesis

El objetivo general de este procedimiento es determinar si dos genes son funcionalmente redundantes para la especificación de una línea celular definida. Esto se logra primero definiendo el fenotipo de pérdida de función de cada gen individual mediante morfolinos específicos para el gen, inyectados en embriones de pez cebra en desarrollo. El segundo paso del procedimiento consiste en desarrollar un ensayo para cuantificar la especificación o diferenciación de la línea celular.

Por ejemplo, utilizando una cepa de pez reportero, como mostraremos aquí. El tercer paso del procedimiento consiste en combinar dos morfo-FENO para dirigirse a la pérdida de función de ambos genes simultáneamente. El paso final del procedimiento es evaluar el fenotipo causado por el doble silenciamiento.

Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren pérdida o ganancia de función en células de una linaje específico mediante el examen del reportero de linaje o el análisis de la expresión de marcadores específicos del linaje. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como combinar genes knockout en el modelo de ratón, es que se pueden dirigir dos o incluso tres genes en el modelo de pez simplemente combinando morfolinos validados en un único experimento. Se pueden inyectar más de 100 embriones y evaluar los fenotipos en el transcurso de varios días.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave. En biología del desarrollo, como al definir las vías transcripcionales que controlan el destino celular, las vías reguladoras clave a menudo están representadas por pequeñas familias de genes relacionados que son funcionalmente redundantes. Por lo tanto, su función no resulta evidente a partir de estudios de eliminación génica en ratones debido a la compensación por parte de los genes hermanos.

Aunque este modelo puede proporcionar información sobre la embriogénesis del pez cebra, los resultados pueden aplicarse a otros sistemas, como el de ratón, ya que los mismos programas genéticos suelen estar bien conservados a lo largo de la evolución. Prepare placas para microinyección antes de inyectar los embriones. Vierta aproximadamente 12 mililitros de agar al 2 % en agua del sistema, que es agua limpia tomada directamente del sistema del acuario, en la tapa invertida de una placa de Petri de 100 milímetros.

Coloque dos portaobjetos en ángulos de aproximadamente 45 grados en los dos lados de la tapa. Cuando el agar haya solidificado, retire suavemente los portaobjetos de la tapa, creando surcos donde reposarán los embriones durante la inyección. Los morfos se mantienen a temperatura ambiente en una concentración de un milimolar en agua destilada estéril desionizada antes de la inyección. Incube los stocks de morfos a 65 grados Celsius durante cinco minutos para asegurar que estén completamente en solución.

Deje que los stocks se enfríen a temperatura ambiente. Cada morfo recién diseñado debe validarse empíricamente por su actividad y la tolerancia del embrión. En tubos de microcentrífuga, comience con una o dos diluciones seriadas del morfo stock en agua destilada desionizada, obteniendo concentraciones de trabajo de un milimolar, 0,5 milimolar, 0,25 milimolar y 0,125 milimolar.

Bajo un microscopio estereoscópico, utilice succión para cargar por la punta una aguja de inyección calibrada que haya sido conectada al micromanipulador y correctamente posicionada. Cargue la aguja con aproximadamente un microlitro de la solución morfo de menor concentración. Utilice una pipeta de transferencia para mover embriones fertilizados de una sola célula hacia las ranuras de la placa de microinyección.

Utilice la pipeta para eliminar el exceso de agua de la placa de modo que los embriones caigan al fondo del canal. Coloque la placa de inyección bajo el microscopio, baje la aguja a través del corion y dentro del vitelo. Inyecte cada embrión antes de retirar la aguja y reposicionar la placa de inyección para acceder al siguiente embrión.

Al aprender a realizar inyecciones, puede ser útil utilizar un colorante vital para visualizar la inyección en la célula como se muestra aquí, transferir los embriones de vuelta a una placa de Petri de 100 milímetros con agua del sistema y cultivarlos a 28,5 grados Celsius. Expulsar cualquier solución de morfolino restante de la aguja y llenarla con la siguiente concentración más alta de morfolino para inyectar el siguiente lote de embriones en una etapa adecuada de desarrollo. Examinar los embriones en busca de fenotipos a cada concentración inyectada de morfolino.

La dosis umbral para cada morfo es la dosis más baja a la que se observa un fenotipo definido y confiable. Pueden ser necesarias varias rondas de titulación para definir con precisión el umbral. Para buscar una interacción genética entre dos genes distintos.

Prepare una mezcla de dos morfos de interés, cada uno a su respectiva concentración umbral. Es importante tener en cuenta que los embriones pueden no tolerar más de 20 nanogramos de morfo total por inyección. Inyecte los embriones de la misma manera que antes.

Mantenga volúmenes de inyección constantes entre los grupos experimentales y de control, que deben incluir conjuntos inyectados con cada morfolino por separado bajo el microscopio estereoscópico. Supervise los embriones inyectados inmediatamente después de la inyección y varias veces a lo largo del día; utilice una pipeta de transferencia para retirar cualquier embrión muerto o moribundo. Dado que estos pueden comprometer la viabilidad de los embriones restantes, con una pipeta de transferencia retire los embriones sedados o eutanasiados en cualquier momento.

Señale una preparación en lámina hundida para su observación. Para fotografía, use pinzas finas para retirar el corion si es necesario.

Estabilice el embrión en una gota de metilcelulosa al 3%. Examine los embriones en busca de un fenotipo distintivo, único para la combinación de morfolinos, en contraposición a una mayor penetrancia del fenotipo de los morfolinos individuales. A continuación se muestran varios embriones de tipo silvestre inyectados con morfolinos en el umbral. Para gata5, el fenotipo típico es cardiobifida o dos corazones, ya que los progenitores no lograron fusionarse en la línea media.

Observe los cardiomiocitos positivos para GFP indicados por las flechas. El fenotipo de seis morfinas incluye corazones malformados que no logran plegarse adecuadamente. Estos embriones también desarrollan cardiomiocitos positivos para GFP.

Sin embargo, los embriones inyectados con una combinación de ambos morfos de gata five y gata six mostrados aquí presentan una pérdida total del desarrollo de cardiomiocitos, lo que indica que debe expresarse ya sea gata five o gata six para que se desarrollen los cardiomiocitos. Ambos genes son funcionalmente redundantes en la especificación de cardiomiocitos.

Al intentar este procedimiento, es importante validar completamente primero sus morfos y estar lo más seguro posible de que representan una reducción real del objetivo de un solo gen tras seguir este procedimiento. Otros métodos, como combinar alelos nulos condicionales en ratones, pueden realizarse para demostrar que los mismos genes tienen función, asimismo, en mamíferos.

Después de ver el video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar si dos genes son funcionalmente redundantes durante la embriogénesis.