Registro del comportamiento multicelular en Myxococcus xanthus Las biopelículas con Time-lapse Microcinematography

El objetivo general del siguiente experimento es desarrollar un ensayo económico de microcinematografía con lapso de tiempo que tenga rigor suficiente para generar resultados reproducibles y cuantificables. Esto se logra empleando juntas de silicona reutilizables y económicas para construir placas de medio con agar o portaobjetos para microscopio. Los resultados obtenidos muestran que estos complejos de placas permanecen hidratados y suficientemente oxigenados durante más de una semana, en una variedad de tipos de medio y concentraciones de agar.

Además, dado que la microcinefotografía con intervalos es un proceso lento, el uso de ocho microscopios económicos ayuda a acelerar la adquisición de datos. Hola, soy Ryan Taylor del laboratorio del Dr. Roy Welch del Departamento de Biología de la Universidad de Syracuse. Hoy les mostraremos un procedimiento para realizar películas con intervalos de biofilms bacterianos en nuestro laboratorio; utilizaremos este procedimiento para estudiar el comportamiento multicelular de los biofilms MTIs.

Así que comencemos. Para iniciar este procedimiento, mida la densidad celular de una cultura nocturna de Occus sanus con un medidor de turbidez, transfiera un mililitro de la cultura a un tubo de centrífuga de 2,5 mililitros, centrifugue, lave y resuspenda las bacterias en medio TPM como se describe en el protocolo escrito adjunto; pipetee y vortexee para resuspender completamente el botón celular, lo cual puede llevar un tiempo. A continuación, añada 0,5 gramos de aros a 50 mililitros de TPM, que es el medio de ensayo.

Además, añada 0,5 gramos de aros a 50 mililitros de C-T-T-Y-E, que es el medio de disco nutritivo, y autoclave para esterilizar. Luego mantenga el medio a 55 grados Celsius en un incubador o baño de agua. Mientras construye el ensayo de rastreo.

Los complejos de placas proceden a construir el disco nutritivo con el primer microscopio de vidrio esterilizado con llama. Deslice y coloque una junta de caucho de silicona estéril de 0,5 milímetros de espesor encima del portaobjetos. Pipete aproximadamente 300 microlitros de medio C TT YE aros en el pocillo formado por la junta sobre el portaobjetos.

El medio de cultivo C-T-T-Y-E agro debe acumularse en forma de montículo; esterilice otra portaobjetos y colóquela en un ángulo sobre los aros del medio de cultivo C-T-T-Y-E. Colocar la portaobjetos en ángulo evita la formación de burbujas. Una vez colocada la portaobjetos, sujete el conjunto firmemente con abrazaderas pequeñas, una en cada lado.

Coloque el complejo recortado a cuatro grados Celsius y deje que el agro de medio C-T-T-Y-E se solidifique. Esto generalmente tarda unos cinco minutos. Una vez que el agro se ha solidificado, se pueden preparar los complejos de placa utilizados en el ensayo de seguimiento.

Comience preparando los portaobjetos para la construcción de los complejos del ensayo. Para cada complejo, flamee dos portaobjetos de vidrio. Coloque una junta de autoclave sobre uno de los portaobjetos para formar la base del ensayo.

El otro portaobjetos se utiliza para aplanar los agros y como portaobjetos de soporte. La parte superior del ensayo es un cubreobjetos. Primero envuelva un portaobjetos con cinta adhesiva para etiquetar, luego esterilice por flama el cubreobjetos de vidrio y colóquelo encima del portaobjetos envuelto y esterilizado.

Deslice hacia arriba los soportes envueltos para sostener el cubreobjetos, evitando que se agriete. Coloque una junta de autoclave sobre el cubreobjetos esterilizado con llama usando pinzas. Presione hacia abajo sobre las juntas del portaobjetos inferior y el cubreobjetos para asegurarse de que formen un sello con el vidrio.

De lo contrario, los medios de los arreglos podrían secarse. Coloque las juntas del portaobjetos y las juntas del cubreobjetos aparte, con los lados esterilizados hacia arriba, y a partir de ahora trabaje solo en un complejo a la vez para evitar que los agros de medio se solidifiquen, lo que resultaría en una mala calidad de la película. Comience colocando el disco nutritivo.

Retire el complejo de disco nutritivo de cuatro grados Celsius. Retire el bind eclipse y separe previamente las laminillas para exponer los aros C-T-T-Y-E ahora solidificados, utilizando una pipeta de muestreo micro con una punta de vidrio desechable de 100 microlitros. Retire un disco nutritivo de un milímetro de diámetro del agar de medio C-T-T-Y-E también y colóquelo en el pozo creado por la junta en la cubreobjetos.

Luego, retire los agros de medio TPM del incubador y pipetee 300 microlitros dentro del pozo creado por la junta en la laminilla y que contiene el disco nutritivo. Los agros de medio TPM deben acumularse hasta aplanar el medio TPM-SA. Coloque uno de los portaobjetos esterilizados con llama, sin junta, en ángulo encima de los agros de medio TPM. Colocar el portaobjetos en ángulo ayuda a prevenir la formación de burbujas.

Sujete el complejo con clips pequeños, uno en cada lado. Coloque el complejo sujeto a cuatro grados Celsius y deje que el medio se solidifique. Esto generalmente tarda unos cinco minutos.

Una vez que el medio haya solidificado, retire el complejo de cuatro grados Celsius. Retire las pinzas sujetadoras y presione el extremo del complejo. Para aflojar la portaobjetos envuelta en cinta, retire la portaobjetos envuelta en cinta y colóquela sobre la bancada para su uso posterior.

Luego, utilizando un par de pinzas como cuña, separe el conjunto de cubreobjetos, junta y medio de agaros complejo del portaobjetos y deseche el portaobjetos. No utilice un movimiento de palanca para separar el conjunto de cubreobjetos y junta, ya que esto podría provocar la rotura del cubreobjetos y/o que el medio de agaros se adhiera al portaobjetos.

Tras retirar el portaobjetos de soporte, coloque el conjunto del portaobjetos con junta y medio de agar sobre el portaobjetos envuelto en cinta con la junta hacia arriba. Coloque este conjunto junto a un mechero para permitir que toda la humedad visible se evapore de la superficie recién expuesta del agar del medio. No permita que el agar del medio se seque durante más de un minuto.

Dado que esto podría afectar el comportamiento de enjambre de M Zant, proceda a sembrar las células en el complejo de ensayo recién preparado. Una vez que se haya evaporado el exceso de humedad del complejo de agarosa en el portaobjetos con junta, aspire 0,5 microlitros de las células concentradas para depositarlas sobre el medio. Aeros deprima la punta de la pipeta antes de acercarse al medio de agarosa.

Una gota de células aparece en la punta de la pipeta, lo que facilita depositar las células sin que la punta toque el agar del medio. Una depresión en la superficie del agar puede alterar el comportamiento del mz del enjambre. Mueva la pipeta directamente hacia abajo para dispensar las células a aproximadamente un milímetro de distancia del disco nutritivo embebido.

Luego, retire la pipeta directamente hacia arriba. De este modo, se asegura que el grupo sea circular. Una vez depositadas las células, coloque el complejo junto al mechero para permitir que la muestra de células se seque durante no más de 20 segundos.

Tras el secado, alinee el conjunto del empaque del portaobjetos que forma la parte inferior del complejo con el empaque de la cubierta. Deslice el medio del empaque acro célula complejo que forma la parte superior del complejo. Presione suavemente para formar un sello.

Limpie las superficies del portaobjetos y la cubierta con una toallita kim para eliminar cualquier residuo y así prevenir la condensación. Coloque el conjunto sobre la platina calentada del microscopio inmediatamente después de limpiar los portaobjetos, con el portaobjetos hacia abajo y la cubierta hacia arriba. Si se ha formado condensación, deje el conjunto sobre la platina calentada durante varios segundos antes de iniciar el software de adquisición de imágenes.

Para preparar la película, seleccione el objetivo apropiado, de 4x, 10x u otro en el microscopio. Encienda la cámara y el microscopio y verifique los niveles de luz para asegurarse de que no sea demasiado intensa. Encienda el ordenador y abra el programa de adquisición de imágenes.

Haga clic en la ventana de la imagen en vivo y enfoque el microscopio. La imagen aparece similar a la que se muestra aquí. Comience a adquirir imágenes.

Asegúrese de verificar el enfoque regularmente durante la primera hora, ya que el agar del medio tiende a asentarse, lo que provoca una deriva del enfoque. Una vez finalizada la adquisición de imágenes, transfiera las imágenes adquiridas para su almacenamiento. Desarme el conjunto del portaobjetos sumergiéndolo en etanol al 90 % durante la noche o desmonte las juntas tóricas para su reutilización.

Esta película de lapso de tiempo muestra embriones sometidos al ensayo de seguimiento descrito aquí. La tasa de captura es de una imagen por minuto con una ampliación de 20x; la velocidad de reproducción es de 60 imágenes por segundo. Esta película de lapso de tiempo muestra una población de hormigas en las que el 1% de las células expresan GFP.

La película se compiló combinando imágenes alternadas de contraste de fase y fluorescencia. El ensayo se realizó en C-T-T-Y-E con una tasa de captura de 1% a una magnificación de 100 x, obteniendo una imagen por minuto. Esta película de lapso de tiempo muestra la motilidad de deslizamiento de M Anthes.

Este ensayo se realizó en C-T-T-Y-E con una tasa de captura de 1 %Aros de una imagen por minuto a una magnificación de 100 x. Esta película de lapso de tiempo muestra la motilidad por sacudidas de P OSA. Este ensayo se realizó en LB con una tasa de captura de 1 %Aros de una imagen por minuto.

Con un aumento de 20x, la velocidad de reproducción es de 60 imágenes por segundo. Esta película de lapsos de tiempo muestra la movilidad colectiva de Smar. Este ensayo se realizó en LB y agar al 1%, con una tasa de captura de una imagen por minuto.

Con un aumento de 20x, la velocidad de reproducción es de 60 imágenes por segundo. Esta película de lapsos de tiempo muestra la motilidad por deslizamiento de EGT. Este ensayo se realizó en LB con 0,5 % de Tag; la velocidad de captura es de una imagen por minuto, mientras que con un aumento de 20x la velocidad de reproducción es de 120 imágenes por segundo debido a la fragilidad del 0,5 % de arose en lv.

Este ensayo emplea el uso de las juntas más grandes que se observan en la figura uno B. Acabamos de mostrarle cómo generar películas de lapso de tiempo de biopelículas bacterianas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar tomarse el tiempo necesario y ser lo más preciso posible para obtener resultados consistentes.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.