Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Hola, me llamo Ena y habitualmente realizamos perfiles de expresión génica en el laboratorio. Utilizamos esta técnica para monitorear los genes regulados diferencialmente entre met y tipo silvestre. Hoy tengo muestras de ARN de tipo silvestre y met, y todos haremos primero la C.

Utilizamos métodos de marcado indirecto y la ventaja de esta técnica es prevenir el sesgo visual que puede ocurrir en el marcado directo. Para ello, contamos con muestras de ARN y optamos por obtener tres microgramos de ARN en un volumen total de 13 microlitros. Y agregamos 2,5 micro de he aleatorio en nuestros tubos.

Y vamos a incubar la muestra a 75 grados para desnaturalizar el ARN durante ocho minutos. Ahora agregaremos el, agregaremos el cóctel de transcripción inversa que contiene mezcla continua de AM L-D-L-D-U-T-P, tampón de transcriptasa inversa y también ET TT Big, y luego incubar la muestra a 42 grados durante cuatro horas. Después de cuatro horas, simplemente retiramos las muestras.

Y ahora en el tubo tenemos una mezcla de ADNc y ARN. Lo que queremos hacer es hidrolizar el ARN añadiendo hidróxido de sodio y EDTA; la concentración final de hidróxido de sodio debe ser de cien molar y la concentración final de EDTA debe ser de cinco molar.

Ahora incubaremos las muestras en un baño de agua a 65 grados durante 10 minutos. La incubación ha finalizado y utilizaremos las muestras añadiendo agua tamponada a pH 7 uno a una concentración final de 500 molar. En este punto, puede almacenar las muestras a menos 20 o continuar con la purificación.

Para la purificación del ADNc, utilizamos el kit de purificación de PCR KaiGen. Sin embargo, dado que el tampón Bush y el tampón iónico contienen freeing, no los usamos; en su lugar, preparamos nuestro propio tampón fate bush y tampón fate ion, y añadiremos 300 litros de PPI, que pipetearemos lentamente. Transferirás la mezcla a columnas y centrifugarás durante un minuto a la máxima velocidad. Luego, añadirás el tampón de lavado que preparamos, el tampón de lavado fosfato, agregando 750 microlitros, y a continuación añadirás otro tanto nuevamente.

Así que volveremos a centrifugar solo para asegurarnos de que obtuvimos todo el precipitado. Y transferiremos estos tubos a tubos receptores vacíos. Añadiré 30 marcadores de tampón fosfato E, que es cuatro molar de fosfato de potasio a pH 8,5.

Y aquí solo necesita asegurarse de que agrega todo al centro de la columna e incuba a temperatura ambiente durante un minuto. Así que girará durante un minuto más y agregaré otro tampón de 30 microcero; incubaré a temperatura ambiente. Luego retiro la columna y obtenemos un volumen total de 60 micros de CDA.

Una vez que purifiquemos el ADNc, puedes almacenarlo a menos 20 grados, y también podemos secarlo y luego almacenarlo, por lo que podemos secar el ADNc mediante evaporación. Entonces, ahora en el tubo tenemos ADNc seco, que está modificado. Y lo que haremos será suspender la muestra seca en.

Suspenderé la muestra en 10 volúmenes de 15 LAR de bicarbonato a pH nueve. Y haré esto moviendo hacia arriba y hacia abajo; en este paso, es muy importante resuspender el ADNc. Bueno, para que la reacción de incorporación funcione, esta reacción debe llevarse a cabo en la oscuridad porque las etiquetas fluorescentes son sensibles a la luz.

Sin embargo, la selección de estos procedimientos proviene de las ciencias de la vida y llegan en paquetes individuales. S cinco tiene tapa morada y side tres tiene tapa naranja, y además S cinco aparece cian cuando se suspende, mientras que Cary aparece magenta. Lo que haré en la habitación oscura es transferir estas muestras a tubos de colorante, volveré a suspender el colorante y luego transferiré las muestras de regreso al tubo que tengo.

Luego, incubaré en la oscuridad durante dos horas; tras esta incubación de dos horas, detendré la reacción añadiendo 35 µL de acetato de sodio 100 milimolar a pH 5,2. Después de eso, purificaremos mediante un procedimiento de purificación similar. Sin embargo, esta vez utilizaremos el tampón de lavado y el tampón de elución proporcionados por Cajun.

Puede describir los lugares donde colocó la muestra y eso debería limpiar el instrumento. Así que puede colocar su muestra o su mezcla ahora mismo en I To. Entonces, esta es mi muestra etiquetada como scifi y aquí lo que observamos es la DO a 260, que indica el contenido de CDA, y la DO a 650, que indica la incorporación de D para scifi. Y aquí está mi muestra etiquetada con side three.

Nuevamente, gire seis concentraciones y cinco medidas de sitio tres incorporaciones. Dado que mi corporación D funciona eficientemente, combinaré muestras ahora. La Sra. Miss lo hará brevemente. Y ahora escribiremos una muestra nuevamente utilizando comentarios.

Vale, para la rehidratación del portaobjetos, lo rehidratamos colocando universalmente el portaobjetos sobre el agua, lo que hará que las manchas aumenten de tamaño. Y luego, para protegerlo, simplemente lo secamos rápidamente a cien grados Celsius y después hibridamos con UV o entrecruzamos las manchas al portaobjetos mediante UV, y a continuación lo incubamos en el tampón de prehibridación que tenemos. Así que coloco el portaobjetos con la cara hacia abajo, pero aún no toca el agua.

Y esperaremos así durante cinco minutos. Yo, como esta caja parece más grande, deberían estar más brillantes que antes de colocarlas, y se secarán rápidamente al poner el portaobjetos a cien grados, y observarán la condensación. Y realizaremos la reticulación junto con ustedes.

Entonces, para la hidratación, simplemente sumerjo el portaobjetos en agua precalentada. Y esto debe ser muy rápido, porque el objetivo aquí es eliminar todos los residuos o todos los oligonucleótidos en el punto que no están ligados. Y si realiza este proceso lentamente, simplemente obtendrá colas de cometa en sus puntos.

Así que asegúrese de hacerlo rápidamente y verifique que no saque su preparación del agua; realice este procedimiento durante 30 segundos y luego coloque inmediatamente a temperatura ambiente durante cinco minutos a 700 rpm de aire. Obtenga esto: colocamos esta laminilla en el tampón de la estación de preincubación que teníamos y empujamos lentamente la laminilla dentro del frasco; luego incubamos a 42 grados durante al menos 45 minutos. Aquí tenemos nuestra muestra seca lista para hibridarse. Primero la resuspendemos en agua.

En este paso, simplemente resuspendemos agitando hacia arriba y hacia abajo, y posiblemente sin exponer demasiado la muestra a la luz blanca. Luego, añadirá ADN de esperma 1.5 de alguien y la concentración es de 10 miligramos por mililitro. Y añadirá 1,2 marcador de ARNt.

La concentración es de 12,5 miligramos por, agregamos ARNt y ADN de esperma de salmón para bloquear la hidrólisis no específica. Y agregamos 5,35 marcador cero tres XSSC, lo que da una concentración final de tres x. Y finalmente agregamos 3,5 microlitros de SDS al 1%.

Ahora herviremos la mezcla durante cinco minutos y luego centrifugaremos a la máxima velocidad durante cinco minutos, y estará listo para eso. Ha pasado una hora desde que incubamos nuestra preparación y en este momento tengo agua y isopropanol. Así que agitaré la preparación primero en agua para eliminar el SDS, luego la lavaré con isopropanol y la colocaré directamente en el calibrador estándar.

Y aquí, tenga cuidado de no exponer demasiado la luz al aire para evitar el secado. Así que paso directamente del tampón de la estación de armado al agua, y lavamos la portaobjetos. Unos minutos, asegurándose de que el movimiento sea solo hacia arriba y hacia abajo, no de lado a lado.

Y también asegúrese de que el portaobjetos no esté por encima del agua y lo transferiremos inmediatamente a isopropanol. Y déjelo aquí nuevamente durante unos minutos. ¿Podría dejar su preparación a temperatura ambiente durante cinco minutos, por favor?

700 R.Cool. Así que nuestra portaobjetos también está listo para ser hibridado y es mejor mantenerlo en una caja de portaobjetos para protegerlo del autobús. Para la estación de cosecha, usaremos elevación o deslizamiento.

Hay tiras blancas en la cubierta que proporcionarán algo de elevación y espacio para que nuestra muestra quede entre la cubierta y la portaobjetos. Y la limpio con etanol, luego coloco el alambre y me aseguro de que no haya partículas de prueba. Primero tomaremos nuestra portaobjetos plantilla, en la que tenemos marcada el área impresa, y encima colocaremos la portaobjetos que preparamos, asegurándonos de que coincidan perfectamente.

Asegúrese de que queden perfectamente alineadas. Y debe verificar que las tiras estén en el costado que vamos a colocar hacia abajo. Es muy difícil de ver, pero asegúrese de que pueda distinguirlas.

Y las franjas deben estar en los lados de las laminillas. Y cargaremos nuestra muestra desde los lados. Tomo pequeñas cantidades de muestra, así que primero tomo 15 microlitros y comienzo a cargar desde la esquina de la cubreobjetos.

Y lentamente lo iría introduciendo mientras me desplazo a lo largo del borde para cubrir toda el área. En esta etapa, es muy importante no introducir burbujas, así que tomo otro migrador de 15 µL y lo aplico al costado de las laminillas para evitar cualquier secado. Nuestra muestra ya está lista y usted incubará nuestras laminillas en cámaras de priorización, que poseen microcanales para hidratar la laminilla mientras se produce la hibridación.

Añadiremos 10 µL de SSC al 3X en seis esquinas del portaobjetos. Había seis lugares en, en la cámara, disculpe, en cada esquina y en cada lado. Asegúrese de transferir el portaobjetos con mucha suavidad para que el cubreobjetos no se deslice. Y cuando coloque el portaobjetos con el lado correcto hacia arriba, verá que se adherirá al agua que colocó; coloque el cubreobjetos y asegúrese de que los tornillos estén bien apretados.

Vamos a incubar la cámara de reacción en una bolsa de agua a 65 grados, pero no queremos colocarla directamente en el fondo. Por lo tanto, colocamos algún tipo de barrera de plástico para evitar una transferencia excesiva de calor. Y colocamos suavemente nuestra cámara de reacción, y para prevenir cualquier desplazamiento, también se puede agregar algún tipo de peso.

Y esta incubación se realizará durante la noche, generalmente entre 10 y 12 horas. Para el lavado del corte, utilizamos un XSSC con SDS al 0,05 por ciento. Esto servirá para eliminar la cubreobjetivo.

Y este será para lavar el primer paso. Y realizaremos otros dos pasos solo con 0.06% de XSC seis veces a través de todo el SDS que tengamos. Así que terminamos la incubación y tomamos los portaobjetos y los colocamos boca abajo en un recipiente para lavado.

Y simplemente agitaremos de un lado a otro y veremos que la cubreobjetos se desprenderá suavemente. Muy bien, y luego la transferiremos a otro tampón de lavado que contiene XES. Incube durante un minuto.

Pase a ir oh seis XSSC. Y para asegurarse de que eliminamos todo el FDS, repetiremos una vez más. Centrifugue para secar a temperatura ambiente durante cinco minutos a 700 RP. Mantenga esta preparación en la caja de portaobjetos porque es sensible a la luz.

Este es el escáner de portaobjetos y colocará el portaobjetos aquí, en este pequeño espacio, con la cara hacia abajo y la etiqueta orientada hacia adentro. En el segundo paso, simplemente definirá el área que desea escanear. Tomará esta área en nuestros portaobjetos. Tenemos, utilizamos 16 pines para imprimir nuestros portaobjetos.

Entonces, cada bloque corresponde a un pin y nuestras láminas contienen más de 8.000 puntos. Representamos el genoma de vi color dos veces porque tiene alrededor de 4.000 genes. Por lo tanto, tenemos dos puntos por cada oligonucleótido que utilizamos.

Y si se amplía la imagen, en este experimento en particular se comparan mutantes del regulador de la transcripción con el tipo salvaje, y el mutante se marca con scifi, que produce un color rojo. El tipo salvaje fue el sitio tres, que produce un color verde. Por lo tanto, cualquier elemento que parezca rojo, como estos puntos, indica que la abundancia de los transcritos en el mutante fue mayor que en el tipo salvaje.

Por lo tanto, aparecen de color rojo o tonos de rojo, y cualquier cosa que aparezca de color verde indica que la abundancia del transcrito fue mayor en el tipo silvestre en comparación con el mutante. Y cualquier punto que aparezca amarillo indica que ese transcrito estuvo presente en igual medida tanto en el mutante como en el tipo silvestre. Por lo tanto, cuando se superponen, aparecerían amarillos como estos buts.