Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo

Las espinas dendríticas son prolongaciones de la membrana del dendrito de una neurona que reciben entradas sinápticas. El alargamiento, encogimiento, aparición o desaparición de espinas ocurre como respuesta a cambios en la función de la red neuronal que resultan de patrones específicos de actividad neural. Este fenómeno se conoce como plasticidad cortical para observar los cambios morfológicos en las espinas dendríticas.

En animales vivos, se fija una placa de imagen al cráneo de un ratón. Un área del cráneo se adelgaza quirúrgicamente y se obtienen imágenes a baja y alta magnificación. Luego, las áreas se vuelven a imaginar en puntos temporales posteriores.

Los resultados obtenidos muestran que la morfología de las espinas dendríticas puede visualizarse claramente mediante una preparación de cráneo delgado en múltiples puntos temporales. Y que la morfología de las espinas es altamente plástica, mostrando cambios en la estructura, así como la aparición y desaparición de espinas dendríticas. Hola, soy Emily Kelly en el laboratorio de Anaya Maka en el Departamento de Neurobiología y Anatomía de la Universidad de Rochester.

Hoy les mostraremos el procedimiento para la imagen crónica de la corteza víscal del ratón tras una preparación llamada fijación. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el recambio de espinas dendríticas. Así que comencemos.

Comience el procedimiento esterilizando las herramientas para cirugía aséptica. Luego esterilice el área de trabajo utilizando etanol al 70% y cubra la superficie operatoria con un campo limpio. Monitoree la profundidad de la anestesia en un ratón anestesiado con una mezcla de fentanilo mediante la prueba de respuesta a un pellizco en el dedo del pie; el ratón mostrado aquí es un ratón transgénico A-G-F-P-M en el que se expresa GFP.

En células parametales de la capa cinco que proyectan procesos dendríticos hacia capas superficiales. Para mantener una temperatura corporal de 37,5 grados Celsius, coloque al animal sobre una manta calefactora y monitórelo con un termómetro rectal adjunto. Luego, aplique una pomada oftálmica en los ojos para evitar que se sequen, utilizando tijeras.

Retire el pelo de la parte posterior de la cabeza del ratón, desde detrás de las orejas hasta los ojos. Luego limpie la parte superior de la cabeza del animal aplicando etanol al 70%, seguido de una fricción con Betadine y solución de Betadine. Realice una incisión LCU detrás de las orejas y hacia arriba a lo largo del lado derecho o izquierdo de la línea media, dependiendo del hemisferio que se va a imaginar hasta los ojos, y doble la piel hacia arriba y lejos del sitio quirúrgico.

No retire la piel ya que se suturará posteriormente utilizando pinzas finas. Tire suavemente de la piel hacia arriba y alejándola del área de interés. Utilizando pinzas limpias, raspe suavemente el periostio del área expuesta del cráneo.

Aplique una pequeña cantidad de cloruro férrico al 10 % sobre el cráneo para secar completamente la membrana perióstica y asegurarse de que haya sido eliminada por completo. Es importante que el cráneo esté completamente seco. Para garantizar una correcta adherencia del pegamento, raspe suavemente la membrana perióstica seca con una hoja de cirugía microquirúrgica.

A continuación, aplique una capa fina de pegamento acrílico Sano alrededor de la ventana de imagen de la placa craneal de acero inoxidable y fije la placa al cráneo. Con el extremo de madera de un bastoncillo de algodón, aplique pegamento en las costuras internas de la ventana de imagen, asegurándose de rellenar todos los espacios entre la placa de imagen y la curvatura del cráneo. Coloque una gota del acelerador de pegamento dentro de la ventana.

Luego, limpie rápidamente el exceso. Deje secar el pegamento una vez que se haya secado completamente. Utilizando un taladro dental equipado con una fresa de acero inoxidable de 0,7 milímetros, comience a adelgazar el cráneo en la ventana de imagen.

Realice perforaciones alternadas con aplicaciones ocasionales de solución salina estéril al 0,9 % para evitar generar demasiado calor en el cráneo. Afile una ventana de cuatro por cuatro milímetros en el cráneo utilizando pequeños movimientos sobre la superficie ósea.

Con la fresa dental. Pruebe la delgadez del cráneo con pinzas de extremo romo. La superficie del cráneo se hundirá ligeramente con presión suave.

El grosor óptimo del cráneo para la obtención de imágenes está entre 10 y 30 micrómetros. Una vez que el cráneo esté afinado, limpie la ventana de todos los residuos y coloque solución salina sobre el cráneo. Fotografíe la ventana de imagen con una cámara digital montada en un microscopio estereoscópico.

La vasculatura cerebral en esta fotografía ayudará a localizar la posición donde colocar la placa de imagen para sesiones posteriores. Transporte al animal al equipo de dos fotones. El animal debe permanecer sobre la manta calefactora y su temperatura corporal debe monitorearse continuamente durante toda la sesión de imagen.

Un microscopio de dos fotones con un láser mi tai. Se utiliza una bomba de estado sólido de 10 vatios para obtener la potencia máxima y una unidad confocal Olympus Flow View modificada. El sistema está optimizado para la obtención de imágenes en tejidos profundos y los detectores externos están instalados lo más cerca posible del objetivo para permitir la máxima detección de fluorescencia procedente del cerebro; agregue una gota de solución salina en la ventana de obtención de imágenes utilizando un zoom digital bajo.

Identifique un área que contenga neuronas intensamente marcadas utilizando una cámara digital fijada al microscopio. Ips, tome una fotografía del área de imagen. Esto es necesario para regresar a la misma ubicación de imagen en un momento posterior.

Obtenga una pila de baja magnificación a través de toda la extensión visible del cerebro que muestre el grado de ramificación dendrítica. Esto se utilizará para localizar el área de imagen en puntos de tiempo posteriores, tanto en vasos sanguíneos como en dendritas. Mantenga su estructura en animales jóvenes y adultos utilizando software de imagen.

Aumente la ampliación digital ocho veces, ajuste las coordenadas XY si es necesario y recopile un conjunto de imágenes de alta ampliación, que mostrará la morfología dendrítica detallada, incluyendo las ubicaciones y la estructura de las espinas dendríticas. Tome notas detalladas sobre la recopilación de cada conjunto, incluyendo las coordenadas de panorámica, el rango de recopilación, el tamaño del paso Z y el número de pasos en el conjunto. Estas notas se utilizarán cuando regrese a esta dendrita o axón en un momento posterior.

Tras la adquisición de imágenes, retire la placa craneal separándola suavemente de la superficie del cráneo. Utilizando pinzas, elimine el adhesivo residual y limpie el cráneo con solución salina estéril al 0,9 %.

Suture la piel sobre el cráneo utilizando hilo de sutura número seis. Limpie el área con etanol al 70 % tras el procedimiento de imagen. Coloque al animal en una jaula limpia bajo una lámpara de calor hasta que despierte y pueda moverse.

Luego, devuelva el animal a su jaula original para volver a obtener imágenes del animal en un momento posterior, que puede variar desde dos días hasta varios meses después; retire las suturas y vuelva a abrir la piel de la cabeza. Utilizando métodos asépticos, emplee la imagen digital de la vasculatura cerebral tomada durante la primera cirugía para localizar la ubicación original de imagen. A continuación, fije nuevamente la placa craneal como antes.

Utilice una hoja microquirúrgica para retirar suavemente cualquier hueso que pueda haber vuelto a crecer entre los puntos temporales de adquisición de imágenes, si es necesario. Afile con una fresa dental, limpie la ventana de imagen de residuos y aplique una gota de solución salina estéril al 0,9 %. Lleve al animal a un microscopio de dos fotones y localice el área original de adquisición de imágenes utilizando la imagen fluorescente digital tomada durante la sesión anterior.

Inicie el programa de vista de flujo. Abra la imagen original con baja magnificación, fije una hoja de transparencia a la pantalla del ordenador y dibuje el patrón principal de los vasos sanguíneos utilizando un rotulador para transparencias. A continuación, abra la imagen en vivo y vuelva a alinear la vasculatura sanguínea con el patrón dibujado en la lámina de transparencia.

Retire la transparencia para volver a obtener imágenes de las estructuras ampliadas ocho veces. Abra la serie deseada recopilada de la sesión de imagen anterior. Dibuje la estructura sobre una película de transparencia fijada a la pantalla del ordenador.

Aumente el zoom ocho veces a partir de la imagen en vivo y alinee la imagen con la transparencia. Dependiendo de la precisión del alineamiento en baja magnificación, puede ser necesario ajustar ligeramente el ángulo de la imagen; configure las coordenadas de desplazamiento según los parámetros de imagen del primer día, incluyendo el tamaño de paso y el número de imágenes. La reimagen de Zack se puede realizar dos veces. El número de veces que se abre el cuero cabelludo debe limitarse para evitar alterar la integridad del cráneo, lo que resultaría en una resolución de imagen deficiente en ratones que expresan GFP.

Se visualizó un subconjunto de células parametales de la capa cinco y los procesos dendríticos correspondientes mediante microscopía de barrido láser de dos fotones in vivo; aquí se muestran dendritas de la corteza visual marcadas con GFP. Esta imagen es una proyección de una única imagen obtenida cada cinco micrómetros desde la PIA hasta una profundidad final de 175 micrómetros. La región enmarcada se muestra aquí con mayor aumento en el día cero y nuevamente en el día cuatro; se comparan imágenes con mayor aumento de una rama dendrítica del día cero y del día cuatro.

Estas imágenes muestran espinas estables indicadas por cabezas de flecha blancas, espinas retráctiles perdidas marcadas con cabezas de flecha rojas y nuevas espinas indicadas por cabezas de flecha verdes. Acabamos de mostrarle cómo realizar imágenes crónicas mediante microscopía de dos fotones en la corteza visual de ratón utilizando una preparación de cráneo delgado. Al realizar este procedimiento, es importante recordar tener especial cuidado durante el proceso de adelgazamiento para evitar daños en el cráneo y en la duramadre subyacente, ya que esto provocará una baja resolución de imagen, y tomar notas detalladas.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.