Un procedimiento de cirugía craneotomía para imágenes cerebrales crónicas

Las técnicas de imagen están volviéndose cada vez más importantes en el estudio de la función cerebral. Entre ellas, la microscopía láser de dos fotones ha surgido como un método extremadamente útil porque permite el estudio del cerebro de la hormiga viva y, con preparaciones adecuadas, la observación crónica de la misma área cortical desde minutos hasta meses.

En este video, mostramos una preparación para la obtención de imágenes crónicas in vivo del cerebro mediante microscopía de dos fotones. La preparación de ventana craneal que demostraremos hoy fue desarrollada inicialmente por el Dr. Carl Voda, investigador del Instituto Médico Howard Hughes en Janelia Farm. Hola y Ricardo Must, del laboratorio de Carlos Porter Cayo en el Departamento de Neurología de la Universidad de California en Los Ángeles.

Hoy vamos a mostrarle el procedimiento para crear una ventana craneal para imágenes crónicas in vivo. Esta preparación es muy útil porque permite obtener imágenes en profundidad dentro del cerebro mediante un microscopio láser de dos fotones. Así que comencemos.

Antes de comenzar la cirugía, los ratones se anestesian con isoflurano: 4 % para inducción y de 1,5 a 2 % para la cirugía, siguiendo procedimientos aprobados por el IACUC. Es importante utilizar pellizcos en la cola y/o en los dedos de los pies para asegurarse de que el animal esté completamente sedado. Con una afeitadora para roedores, se afeita el pelo desde la parte posterior del cuello hasta los ojos.

Tras afeitar, se coloca al ratón en un marco estereotáxico, sobre una manta con recirculación de agua ajustada a 37 grados Celsius, y se sujeta firmemente la cabeza utilizando barras para las orejas. A continuación, se aplica una pomada oftálmica para evitar que se seque el ojo del animal. Después, se administran subcutáneamente dexametasona, 0,2 miligramos por kilogramo, y carprofeno, cinco miligramos por kilogramo.

Con el fin de prevenir respectivamente la hinchazón del cerebro y una respuesta inflamatoria. Antes de comenzar la cirugía, asegúrese de esterilizar el área operatoria limpiando la piel con tres hisopos alternados de alcohol al 70 % y Betadine. Todos los instrumentos quirúrgicos han sido previamente esterilizados utilizando un esterilizador de perlas de vidrio, empleando tijeras que han sido rociadas con etanol.

Se retira la piel de la parte superior del cráneo, comenzando con un corte horizontal a lo largo de la base de la cabeza, seguido de dos cortes en dirección rostral, casi hasta alcanzar los párpados. Luego, dos cortes oblicuos que convergen en la línea media. En este punto, se aplica una gota de solución de lidocaína y epinefrina sobre el periostio para evitar sangrado excesivo o dolor; con un bisturí, se retrae el periostio hacia los bordes del cráneo.

La musculatura de la parte posterior del cuello también se retrae ligeramente. Luego, se raspa suavemente con un escalpelo toda el área expuesta del cráneo para crear una superficie seca. Esto es muy importante porque permitirá que el pegamento se adhiera mejor cuando se aplique posteriormente.

Una vez que se ha elegido un sitio de imagen, se está listo para crear primero la ventana craneal. Se dibuja suavemente un círculo de aproximadamente cuatro milímetros de diámetro con una fresa neumática dental. Después de una ligera perforación, se aplica nuevamente solución de lidocaína con epinefrina sobre la superficie del cráneo.

Se detiene la perforación cuando queda una capa muy delgada de hueso, generalmente un tabique nasal. Esta etapa se alcanza empujando suavemente el centro de la craneotomía para percibir cómo cede bajo una gota de solución salina y aprovechando la trabea ósea, una estructura esponjosa del hueso.

La craneotomía se levanta del cráneo con pinzas de punta muy fina. La solución salina es importante porque ayudará a levantar el cráneo y prevenirá el sangrado de la duramadre. A continuación, se aplica espuma de gel, previamente empapada en solución salina, sobre la duramadre para detener cualquier pequeño sangrado que a veces ocurre al retirar el cráneo.

Después de secar la superficie de la duramadre y asegurarse de que no haya sangrado, se coloca suavemente una cubreobjetos estéril de cinco milímetros encima de la duramadre. Se aplica una gota de pegamento a base de cianoacrilato en el hemisferio opuesto del cráneo. Con la ayuda de una aguja, se aplica el pegamento suavemente alrededor de toda la ventana, teniendo cuidado de no colocarlo debajo del vidrio.

Ahora se puede aplicar una capa delgada de pegamento sobre toda la superficie del cráneo. Una vez que el pegamento se ha secado, se mezcla y aplica acrílico dental sobre toda la superficie del cráneo, cubriendo también un pequeño borde de la lámina de cubierta para asegurarla. Después de fijar la lámina de cubierta, se forma un pequeño pozo alrededor de la ventana con acrílico dental.

Una barra de titanio también está incrustada en el acrílico dental. Esta barra se utilizará posteriormente para fijar al ratón de forma segura sobre la platina del microscopio. Para la obtención de imágenes, es importante asegurarse de que la barra esté nivelada, de modo que quede paralela a una ventana craneal.

Colocar un trozo de papel debajo de la barra puede permitir que esta permanezca nivelada mientras el acrílico se endurece; se deja que el acrílico dental cure o se endurezca durante 10 minutos, momento en el cual la barra de titanio ha quedado fijada en su lugar. Luego, el animal se coloca en una jaula caliente hasta que se recupere. Después de la recuperación de la anestesia, el animal puede ser sometido a imágenes el mismo día.

Esta película muestra una serie de 160 imágenes tomadas a intervalos de cinco micrones con nuestro microscopio personalizado de dos fotones a través de una ventana craneal colocada sobre la corteza somatosensorial de un ratón GFPM de tres meses de edad. Esta línea transgénica de ratones expresa GFP en un pequeño subconjunto de neuronas parietales. En la capa cinco y la capa dos tres, la imagen se obtuvo con un objetivo de inmersión en agua de 40 x y una apertura numérica de 0,8, utilizando una longitud de onda de excitación de 910 nanómetros.

En las imágenes más superficiales, es fácil reconocer los arborizaciones dendríticas de las dendritas apicales de las células parametales. La ramificación apical de las dendritas de cada neurona converge en una única dendrita apical grande. También pueden observarse dendritas oblicuas más pequeñas que emergen de esta dendrita apical principal; asimismo, son evidentes axones que cruzan el campo de visión.

Esta es una pila de 12 imágenes tomadas cada uno coma cinco micrómetros utilizando el mismo objetivo de 40x con mayor aumento, en la que se muestra una dendrita superficial con resolución suficientemente alta como para distinguir espinas dendríticas individuales. Acabamos de mostrarle cómo realizar una preparación de ventana craneal para imágenes crónicas del cerebro mediante microscopía óptica. Este es un método sumamente poderoso para el estudio del cerebro porque permite investigar tanto la estructura como la función del cerebro en vida, no solo en una sola imagen, sino también de forma crónica mediante múltiples imágenes durante períodos de meses.

Otra ventaja de la preparación de la ventana craneal es que se puede obtener un campo de visión amplio, lo que permite imaginar estructuras grandes como una acción completa o el árbol dentado a lo largo de varios milímetros. Al realizar este procedimiento, es importante recordar trabajar en las condiciones más limpias y estériles posibles y tener una mano muy firme. Bien, y eso es todo.

Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.