Pseudofracture: Un Modelo periférica aguda trauma tisular

Cuando se fractura un hueso largo, como el fémur o la tibia, el músculo lesionado y los tejidos blandos quedan expuestos a fragmentos óseos dañados y a la médula ósea. A continuación, se desencadena una fuerte respuesta inmunitaria que contribuye a la reparación del tejido. Un modelo para estudiar los efectos de esta exposición puede generarse mediante la recolección de ambos fémures y tibias.

De un ratón donante. Los huesos se trituran para crear una solución ósea, que luego se inyecta en el muslo lesionado de un ratón receptor. A continuación, se monitorean las respuestas inmunitarias y se evalúan las lesiones en órganos distantes para estudiar los efectos a largo plazo del trauma inducido por fractura.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes de trauma en tejidos periféricos, como el modelo de fractura bilateral de fémur, es que este modelo, el modelo de pseudo fractura, permite la supervivencia a largo plazo sin complicaciones derivadas de anestesia prolongada ni de técnicas intrincadas de fijación de fracturas, y por tanto permite el estudio de las respuestas inmunitarias en fases tardías tras el trauma. Antes de comenzar el procedimiento, prepare los siguientes materiales: un cubo de hielo, instrumentos quirúrgicos Betadine, pinzas hemostáticas GRE, un mortero y un pistilo, pinzas, agujas de calibre 20, una jeringa de un CC, anestesia con PBS y un cono nasal para isoflurano. Un solo animal sacrificado, apareado por edad y peso.

El ratón donante genético debe proporcionar suficiente material para tres receptoras. Sujete al donante a una placa de plexiglás, asegurándose de fijar solo las extremidades inferiores en la punta del pie. Afeite cuidadosamente las extremidades inferiores.

Luego, cúbralos completamente con Betadine y alcohol para garantizar la esterilidad, retire los huesos largos de la extremidad inferior, realice una incisión quirúrgica en la piel de la región inguinal y continúe cortando la piel a lo largo de toda la extremidad hasta el tobillo, retraccione la piel y deséquela del tejido celular subcutáneo y del músculo, tanto en las caras medial como lateral. A continuación, inserte una hoja de la tijera por debajo de los músculos que se encuentran anteriores y laterales a la tibia. Deslice la hoja proximal y distalmente para levantar los músculos limpiamente desde el hueso subyacente.

Repita esta técnica en la cara posterior y medial de la parte inferior de la tibia para separar los músculos situados debajo de la tibia. Se debe emplear un esfuerzo adicional mínimo en el lado posterior al deslizarse hacia distal para fracturar el peroné lejos de la tibia en el extremo proximal de estos músculos de la pierna. Corte los tendones lo más cerca posible de sus inserciones y retraccione los músculos hacia distal mientras tira del grupo muscular en conjunto de forma descendente; un pequeño tirón liberará las inserciones distales de la articulación del tobillo, cortando con tijeras a través de la articulación del tobillo.

No separe la tibia del fémur en este momento; esta conexión proporciona una palanca adicional que facilitará la disección del fémur desde la articulación de la cadera. Utilice una técnica similar para liberar los músculos del fémur. Realice esto posteriormente y tanto medial como lateralmente, si es necesario.

Corte la inserción distal de estos grupos musculares para liberarlos de la articulación de la rodilla. Amplíe la incisión cutánea según sea necesario para lograr una exposición adecuada y continúe por debajo de los músculos. Para diseccionar el extremo del fémur fuera de la articulación de la cadera, retire el fémur y la tibia unida del ratón donante y colóquelos sobre gasa estéril.

Separe los dos huesos en la articulación de la rodilla simplemente sujetando cada hueso con una mano distinta y girando o rotando suavemente los dos huesos en direcciones opuestas a lo largo de sus ejes longitudinales. Para eliminar los restos de inserciones tendinosas de los huesos largos, envuelva un trozo de gasa de cuatro por cuatro alrededor de la longitud del hueso. Sujete firmemente y raspe toda la longitud de los huesos varias veces para eliminar los tejidos residuales de la superficie.

Coloque los huesos recolectados en un tubo microfuger estéril de 1,5 mililitros sobre hielo. Transporte los huesos del donante a una cabina de seguridad biológica debidamente desinfectada. Para la preparación de la solución ósea.

La campana debe prepararse con un campo estéril, un mortero y un pilón estériles, una pinza estéril, un tubo estéril de ocho mililitros, PBSA estéril, una pipeta de un mililitro con puntas de pipeta respectivas. Un pipeteador de 100 microlitros con sus puntas respectivas, jeringas de un mililitro y agujas de calibre 20. Con ayuda de la pinza, transfiera los huesos al mortero y utilice el pilón para triturar suavemente los huesos. Pipete un mililitro de PBS en el mortero y continúe triturando los fragmentos restantes mediante movimientos circulares para asegurar una completa resuspensión.

Luego, agregue otro mililitro de PBS y continúe machacando para crear la solución ósea, que debe tener un tono rosado. Vierta lentamente la solución del mortero al tubo de ocho mililitros, asegurándose de que cualquier residuo más grande quede retenido. Transfiera la solución ósea a una jeringa de un mililitro.

Con una aguja de calibre 20, la solución ósea debe mantenerse sobre hielo. Pipetee un microlitro de la solución ósea sobre una placa Mac congar, distribuyéndola uniformemente sobre la superficie. Incube la placa durante 24 a 48 horas para asegurar la esterilidad.

Comience el procedimiento quirúrgico para la lesión de tejido blando y la inyección de solución ósea evaluando la profundidad de la anestesia de un ratón anestesiado con pentobarbital mediante una compresión del dedo del pie. Coloque al ratón en posición supina sobre una placa de plexiglás e inmovilice al animal envolviendo ligeramente tiras delgadas de cinta adhesiva con el lado pegajoso hacia afuera alrededor de la porción distal de cada extremidad utilizando Oscar cinco alicates con una cuchilla tamaño 40. Afeite las regiones abdominal, inguinal y del muslo del animal.

Transfiera el ratón al campo quirúrgico estéril. Limpie el área quirúrgica con Betadine. Luego limpie con alcohol para esterilizarla.

Coloque un cono nasal en el ratón que contenga un trozo de gasa con un mililitro de isoflurano al 99%. Una vez que la respiración del animal comience a disminuir, retire el cono nasal. Si se requiere anestesia adicional en cualquier parte del procedimiento, se puede inyectar pentobarbital adicional o administrar más isoflurano.

A continuación, doble un apósito estéril y colóquelo sobre el ratón de manera que solo queden expuestas las extremidades inferiores y la cabeza. Esta lesión de tejidos blandos es una lesión por aplastamiento bilateral de las extremidades posteriores. Asegúrese de que el ratón esté posicionado con las extremidades posteriores ligeramente abducidas y rotadas lateralmente.

Esto ayuda a acceder al músculo correcto. Agrupe los flexores de la rodilla para realizar la lesión por compresión. Coloque un hemostato grande de 18 centímetros alrededor del punto medio de la musculatura posterior del muslo a lo largo del fémur, con su curvatura convexa orientada hacia el fémur. Bloquee el hemostato en posición cerrada con un solo clic durante 30 segundos.

Introduzca la aguja a través de la piel dos o tres milímetros, justo cuando la punta del bisel toque el fémur. Inyecte 0,15 mililitros de la solución ósea en el músculo del muslo triturado en cada lado. Retire la aguja y coloque rápidamente un dedo con guante estéril sobre el sitio de inyección para evitar cualquier reflujo de la solución ósea fuera de la herida.

Mantenga este dedo allí durante varios segundos. Devuelva el ratón a la jaula y permita total libertad de movimiento tan pronto como el anestésico remita. Apropiado. Se debe administrar un manejo adecuado del dolor cuando el ratón despierte.

Este esquema general muestra la respuesta inmunitaria bifásica tras un traumatismo en el punto de tiempo cero horas. Se induce un traumatismo. A continuación, se produce una respuesta inflamatoria hiperaguda que alcanza su punto máximo a las seis horas y se mide mediante la evaluación de la inflamación sistémica y la disfunción de órganos distantes.

El segundo componente de la respuesta inmunitaria pos traumatismo es una inmunosupresión retardada, medida mediante la disfunción de las células inmunitarias, y se representa como un valle alrededor de las 48 horas. Este es un diagrama representativo de la respuesta de citocinas inflamatorias en plasma que ocurre poco después del traumatismo y es un ejemplo de inflamación sistémica. La disfunción de órganos distantes, evaluada mediante lesión hepática, se encuentra elevada dentro de un período de tiempo similar.

Este diagrama representativo es un ejemplo para resaltar la disfunción de las células inmunitarias en una fase tardía tras un traumatismo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar garantizar la esterilidad y la manipulación precisa durante todo el experimento. Este no es un modelo de fractura real ni de infección de herida.