El estudio de los efectos de la matriz de rigidez en la función celular usando como base la acrilamida-hidrogeles

Para modelar la compliancia de tejidos in vivo utilizando hidrogeles de acrilamida. Esto se logra primero generando cubreobjetos reactivos en la parte inferior y cubreobjetos superiores silanizados. El segundo paso del procedimiento consiste en verter y crear los hidrogeles de acrilamida.

El tercer paso del procedimiento consiste en el entrecruzamiento de la proteína de matriz extracelular elegida con el hidrogel. El paso final del procedimiento es la incubación y el análisis de las células. En definitiva, se pueden obtener resultados que demuestran cómo la variación de la rigidez de la matriz extracelular in vitro regula el comportamiento celular mediante análisis por microscopía de inmunofluorescencia, PCR cuantitativa en tiempo real y transferencia de Western.

Hoy les mostraremos el procedimiento para la generación y el uso de hidrogeles de acrilamida. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar cómo la rigidez de la matriz extracelular regula la morfología celular, la señalización celular y la proliferación. Así que comencemos.

Comience este procedimiento generando cubreobjetos reactivos. Primero, coloque una capa de paraformo en la mitad inferior de una placa de Petri de 150 milímetros. Luego, transfiera hasta nueve cubreobjetos de 25 milímetros autoclavados sobre la película de para y cúbralos con un mililitro de hidróxido de sodio 0,1 molar.

Incube los cubreobjetos durante tres minutos. Tras la incubación, aspire el hidróxido de sodio con una línea de vacío trabajando en una campana química y agregue 0,5 mililitros de tres amino perfil trimetil o tres A-P-T-M-S sobre cada cubreobjeto mediante pipeta. Incube los cubreobjetos durante tres minutos y luego aspire el tres A-P-T-M-S. Tenga cuidado de no incubar demasiado tiempo para evitar la formación de espuma sobre el cubreobjeto.

Portaciones después del tratamiento. Enjuague las portaciones una vez con 20 mililitros de agua desionizada en el mismo recipiente. Retire las portaciones del recipiente utilizando fórceps curvos y transfiéralas con la cara tratada hacia arriba a un nuevo recipiente de 150 milímetros.

Luego, lave las laminillas con agua desionizada nuevamente y colóquelas sobre el agitador durante 10 minutos. Tras la incubación, retire el agua y realice dos lavados adicionales. Es muy importante eliminar todo el A-P-T-M-S, para que no reaccione con el glutaraldehído y deje un precipitado blanco turbio 10 minutos antes del uso del glutaraldehído.

Utilizando pinzas curvas, transfiera los cubreobjetos a un recipiente limpio forrado con papel de filtro y aspire cualquier líquido residual utilizando una línea de vacío. Luego, cubra completamente cada cubreobjeto con 0,5 mililitros de glutaraldehído al 0,5 % en agua desionizada estéril para entrecruzar los tres A-P-T-M-S y el gel de poliacrilamida. Incube los cubreobjetos durante 30 minutos en una campana química. A continuación, aspire el glutaraldehído y lave nuevamente los cubreobjetos con agua desionizada.

Luego seque completamente las laminillas. Añada laminillas nuevas a un tubo Falcon de 50 mililitros que contenga una solución al 10% de sellador de superficie en cloroformo y agite durante al menos 10 minutos. Vierta la solución de sellado de superficie y seque al aire.

Coloque las laminillas sobre toallas Kim en la cabina de seguridad biológica donde se prepararán los hidrogeles para comenzar la preparación. Utilice pinzas curvas para transferir las laminillas con el lado reactivo hacia arriba a una hoja de paraforma que haya sido fijada con cinta adhesiva sobre la superficie de la cabina de seguridad biológica. Asegúrese de que las laminillas queden planas sobre la superficie de la paraforma.

Luego, prepare una solución saturada de CIN hidroxilado o de NHS en tolueno disolviendo una pequeña cantidad de NHS en suficiente tolueno. Para los experimentos específicos, agregue pequeñas cantidades de NHS hasta que el NHS ya no se disuelva. La solución saturada generalmente es turbia y de color rosa.

A continuación, prepare la acrilamida, BIS acrilamida, agua y un PS para alcanzar el porcentaje deseado de acrilamida. Añada los reactivos a los tubos de microuso según se indica en el protocolo escrito. Luego, un alícuota a la vez.

Agregue la NHS y la TM me. Vortexee brevemente el tubo e inmediatamente vierta entre tres y cinco geles utilizando 140 microlitros por cubreobjetos en las cabinas de seguridad biológica. Coloque rápidamente el cubreobjetos SILICONADO de 25 milímetros encima de cada gel antes de que comience a polimerizar.

La adición de la cubreobjetos superior permitirá que el acrilamida cubra completamente la cubreobjetos inferior. Incubar este sándwich a temperatura ambiente hasta que el acrilamida se polimerice para determinar cuándo ha ocurrido la polimerización. Verificar la solución residual de acrilamida en el tubo de microcentrífuga.

La polimerización tardará unos minutos en los geles rígidos y un poco más en los geles blandos. Una vez que haya ocurrido la polimerización, levante cuidadosamente el sándwich usando guantes estériles. Luego deslice la cubeta superior hasta que sobresalga del gel polimerizado.

Luego levante la tapa. Retire el gel y deseche la cubierta superior. Coloque cada cubierta inferior del gel, en adelante denominada hidrogel, en una placa de seis pocillos.

A continuación, agregue dos mililitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS por pocillo de una placa de seis pocillos. Luego, lave los hidrogeles con PBS e incube en un agitador rotatorio durante cinco minutos. Repita este lavado dos veces.

Para comenzar el experimento, cubra cada hidrogel con dos mililitros de una solución de fibronectina u otra proteína de matriz extracelular. Incube la proteína sobre el hidrogel durante la noche a cuatro grados Celsius para permitir su unión covalente al hidrogel; tras la incubación nocturna, aspire la solución de matriz extracelular. Luego, bloquee los grupos NHS no reactivos con un miligramo por mililitro de albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos y activada por calor, en medio libre de suero, e incube durante al menos 30 minutos a 37 grados Celsius.

Después de la incubación, lave los hidrogeles una vez con PBS estéril. A continuación, siembre las células en el medio de cultivo apropiado que contenga suero bovino fetal sobre el hidrogel aquí.

Se utilizan fibroblastos embrionarios de ratón establecidos. Determine el número de células que se sembrarán en el hidrogel según el grado de expansión celular y la confluencia requeridos para el experimento. Aproximadamente 10 a la cinco células son necesarias para el análisis mediante blot de Western y PCR cuantitativa.

Luego, incubar las células en condiciones apropiadas para el tipo celular específico. Tras el período de incubación, extraer la proteína celular o el ARNm según sea necesario.

Pipetee gotas de 100 microlitros de tampón de lisis sobre una hoja de paraformo en la bancada del laboratorio, dejando aproximadamente de dos a tres centímetros entre cada gota. A continuación, retire cuidadosamente cada hidrogel levantando la cubreobjetivo inferior del pocillo. Utilice fórceps curvados y coloque su lado celular hacia abajo encima de las gotas.

Incube las células con el tampón de lisis durante exactamente un minuto. Finalmente, retire las laminillas y transfiera el tampón de lisis a un tubo de microcentrífuga. Alternativamente, cuando se extraiga ARN, transfiera cada hidrogel a una nueva placa de seis pocillos y agregue un mililitro de triazol por pocillo.

Incubar los geles durante tres minutos tras la incubación. Retire la solución de triazol para su almacenamiento en un tubo de microcentrífuga. El lavado exhaustivo de las laminillas tras la adición de A-P-T-M-S es un paso importante para obtener laminillas reactivas.

Las laminillas lavadas y secas adecuadamente están libres de cualquier residuo de precipitado. El A-P-T-M-S reaccionará con el glutaraldehído y producirá un precipitado blanco turbio. Si aparece el precipitado, todo el procedimiento debe repetirse, ya que la laminilla ya no es utilizable.

Después de la formación del hidrogel y el recubrimiento con proteínas de la matriz extracelular, se siembran las células durante la noche. Existe una diferencia clara entre la expansión celular sobre hidrogeles rígidos frente a blandos, como puede observarse mediante el plegamiento en la tinción; las células de fibroblastos embrionarios de ratón se expanden más sobre hidrogeles rígidos en comparación con los blandos. De hecho, la mayoría de las células que se adhieren a un hidrogel blando permanecerán compactas y se adherirán con menor eficiencia.

Los resultados representativos de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de los niveles de ARNm de ciclina D1 en fibroblastos embrionarios de ratón muestran que la ciclina D1 se sobreexpresa significativamente en una matriz rígida, pero no en una matriz blanda. Esto sugiere que la rigidez de la matriz regula la progresión del ciclo celular in vitro. Acabamos de mostrarle cómo generar hidrogeles con rigidez controlada, modelando así las condiciones fisiológicas in vivo. Al realizar este procedimiento, es importante recordar preparar cubreobjetos reactivos adicionales, ya que pueden ocurrir accidentes o errores.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.