La administración oral de la rotenona con una sonda y Análisis de Imágenes de la alfa-sinucleína inclusiones en el sistema nervioso entérico

Los síntomas de la enfermedad de Parkinson, incluyendo la disfunción motora y del habla, resultan de la actividad reducida de las células que secretan dopamina en el cerebro. El sistema nervioso entérico y el bulbo olfatorio son las estructuras nerviosas más expuestas y las primeras en verse afectadas. Se ha asociado la enfermedad de Parkinson con la exposición a pesticidas.

Con el fin de analizar los efectos de los pesticidas sobre el sistema nervioso entérico, se administra el pesticida roone a ratones mediante gavaje oral. Luego, se realiza una perfusión intracardiaca en los ratones con paraformaldehído al 4 % para fijar el cerebro y el sistema nervioso entérico. Se extrae el tejido, se prepara y se inmunotinciona para las proteínas asociadas con la enfermedad de Parkinson.

Las imágenes de beta tres tubulina y alfa-sinucleína adquiridas mediante microscopía confocal demuestran la acumulación de alfa-sinucleína dentro de las neuronas del sistema nervioso entérico en animales expuestos a pesticidas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la administración sistémica de rotenona es que, al utilizar este método, se asegura que el efecto de la rotenona se limite al sistema nervioso entérico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la enfermedad de Parkinson, como su etiología y los mecanismos que subyacen a su progresión.

Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia y al diagnóstico de la enfermedad de Parkinson, ya que permitirán el desarrollo de nuevos objetivos terapéuticos y métodos diagnósticos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la fisiopatología de la enfermedad de Parkinson, también puede aplicarse a otros sistemas, como el estudio del efecto de otras toxinas ambientales sobre los sistemas nerviosos entérico, simpático y parasimpático, así como sobre la pared intestinal. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se necesita cierto tiempo para dominar la administración por cánula.

La primera vez que tuve la idea de estos métodos fue cuando leí sobre la relación entre los pesticidas y la enfermedad de Parkinson. También fue útil asistir al congreso de alta CORA en el Congreso Mundial sobre Parkinson en Berlín en 2005. Es necesario demostrar pacíficamente este método.

El método para administrar ol mediante gavaje es difícil, ya que los ratones tienen una anatomía diferente a la de los humanos; por otro lado, el análisis de imágenes se realizó con pasos personalizados para estas imágenes. Comience el protocolo pesando el animal. Calcule el volumen adecuado de rotenona.

Se necesitan 0,01 mililitros por gramo de peso del animal, lo que corresponde a una dosis de cinco miligramos por kilogramo de roone. Cargue una jeringa de un mililitro con la solución de roone y luego cargue una segunda jeringa con la solución vehicular. Tome el ratón y sostenga la cola del ratón con una mano.

Estire la piel del cuello tirando de ella con los dos primeros dedos de la otra mano. Una vez que la cabeza esté fijada entre los dos dedos, apóyela contra la palma de la mano y gírela boca abajo. Fije la cola.

Utilizando el cuarto y quinto dedo, manteniendo la cabeza hacia atrás, presione el paladar para abrir la boca del ratón. Introduzca suavemente la sonda de gavaje en la boca. Mueva lentamente la sonda en dirección al estómago hasta que se inserte por completo.

Para evitar que el material entre en los pulmones, administre la solución de roone o el vehículo presionando suavemente el émbolo. Una vez finalizado, retire lentamente la sonda de gavaje y coloque al animal en otra jaula hasta que todos los animales de una jaula hayan sido tratados. Después del tratamiento, los ratones se perfunden por vía intracardíaca con paraformaldehído al 4%.

En PBS, los intestinos se extraen mediante disección y se colocan en sacarosa al 15% durante la noche. Al día siguiente, el tejido se transfiere a sacarosa al 30% y se incuba nuevamente durante la noche a cuatro grados Celsius. Luego, el tejido se coloca en un congelador a menos 80 grados Celsius y se almacena hasta su uso. Usando un criostato, el intestino de 20 micrones.

Se transfieren secciones transversales a portaobjetos, seguido de los procedimientos de bloqueo y tinción inmunológica. Luego se realizan los pasos con anticuerpos anti beta tres tubulina y anti alfa sinucleína. Se recomienda que una persona externa realice un análisis ciego de los datos.

Para comenzar el análisis, abra el software Fiji. Abra el archivo de imagen confocal. Luego, separe los canales para poder trabajar en cada canal de forma independiente.

Cierre los canales que no se van a utilizar y seleccione, analice, configure, escale y establezca el tamaño del píxel en uno. Establezca la distancia conocida en 0,13 y haga clic en global. Ahora el tamaño de la imagen se mostrará en micrones.

Seleccione el canal de alfa-sinucleína y seleccione el ganglio. Asegúrese de que la selección encierre el ganglio en todos los cortes. Duplique la imagen con el ganglio seleccionado; solo se duplicará una imagen del tamaño del ganglio.

Pulse editar para que todo lo que esté fuera de la región seleccionada en la imagen se vuelva negro. Duplique la imagen nuevamente para determinar qué tan bien se realizó el procedimiento. Las imágenes que tengan una baja relación señal-ruido de fondo no deben utilizarse para el análisis de imágenes.

Seleccione la imagen y ajuste el umbral. Luego, seleccione entropía máxima. A continuación, desplácese por las secciones en la imagen recortada y en la original para asegurarse de que el procedimiento se haya realizado correctamente.

El umbral trópico selecciona un nivel de señal de intensidad basado en el histograma de la imagen, y solo se mostrarán aquellos píxeles con intensidades superiores a este umbral en un proceso de selección de imagen en blanco sobre negro. A continuación, haga clic en suavizar. Este paso transforma los bordes pixelados de las imágenes en bordes suaves en el proceso de selección.

Luego, haga clic en binario y elija Crear binario. La imagen se mostrará como una imagen en blanco y negro. Duplique la imagen para realizar el siguiente paso sobre la imagen duplicada; haga clic en Analizar, Analizar partículas. A continuación, seleccione Mostrar contornos y haga clic en Resumir.

El resto de la configuración debe dejarse en los valores predeterminados. Esta función reconoce el número total de píxeles con señal y aquellos que están agrupados, así como la superficie total de píxeles con señal. Además, se informa el número de grupos de píxeles y el tamaño medio.

Compare y seleccione la rebanada con el área total más grande que se ajuste bien. Se marcará la rebanada. Copie la tabla de datos con la superficie total de alfa-sinucleína, el número de inclusiones y el tamaño medio de las partículas.

Pegue los datos en una hoja de cálculo de Excel o anótelos en otro lugar. Regrese a Fiji. Busque la rebanada previamente seleccionada en el canal de beta tubulina y selecciónela.

Seleccione el área del ganglio y haga clic en analizar. Luego seleccione medir. Aparecerá otra tabla que mostrará la superficie total del ganglio.

Extraiga los datos de la tabla a una hoja de cálculo de Excel cerca de la medición de alfa-sinucleína o cópielos en otro lugar utilizando Excel. Divida los diferentes parámetros obtenidos en la medición de alfa-sinucleína por la superficie del ganglio para obtener la superficie total de alfa-sinucleína y el número de inclusiones normalizados por el tamaño del ganglio, con el fin de analizar los efectos de rotenona actuando localmente sobre el sistema nervioso entérico; cinco miligramos por kilogramo del pesticida rotenona se administraron por sonda oral a ratones C57 negro seis de un año de edad. El cromatograma mostrado aquí muestra la presencia de un pico de rotenona una hora después de la administración; controles y ratones tratados con 20 miligramos por kilogramo de rotenona y cinco miligramos por kilogramo de rotenona.

Los niveles de rotenona se determinaron en extracciones de sangre, cerebro y bulbo raquídeo mediante HPLC, como se muestra aquí. La administración de cinco miligramos por kilogramo de rotenona por gavaje oral no produce niveles medibles en sangre una, dos o tres horas después del tratamiento, según determinó el HPLC. Este gráfico muestra los niveles de rotenona en el cerebro y el bulbo raquídeo de ratones tratados.

Una hora después de la administración de la extracción de 10 miligramos por kilogramo o menos de rotenona, no se observan niveles de rotenona en muestras de cerebro o bulbo raquídeo. Una hora después de la administración, la actividad del complejo mitocondrial I se evaluó en muestras de músculo y cerebro de ratones tratados durante 1,5 meses. No hay diferencia significativa entre los grupos, lo que indica que no hubo inhibición del complejo mitocondrial I, confirmando así que no había rotenona en estas regiones.

Análisis del componente de cuerpo de Lewy alfa-sinucleína en la enfermedad de Parkinson tras la administración de rone permite la determinación confiable de la cantidad total de alfa-sinucleína en la superficie, la presencia de inclusiones de alfa-sinucleína y el patrón de alfa-sinucleína en la célula. Esta figura muestra la tinción con anticuerpos anti beta tres tubulina, alfa-sinucleína y DAPI en secciones de duodeno e íleon, como se puede observar aquí. Un tratamiento de 1,5 meses con roach conocido indujo un patrón punteado aumentado de alfa-sinucleína dentro de los ganglios del sistema nervioso entérico, incluso en comparación con los controles de tres meses.

Este patrón puede observarse tanto en el íleon como en el duodeno. Tras tres meses de tratamiento, la formación de inclusiones más grandes de alfa-sinucleína puede verse mediante tinción inmunofluorescente utilizando anticuerpos contra alfa-sinucleína, así como con tioflavina y DPI, que demuestran la agregación de acumulaciones más grandes de alfa-sinucleína únicamente a los tres meses. Este experimento se analizó utilizando métodos automáticos de segmentación y umbralización basada en entropía.

En el gráfico de la izquierda, cada columna representa el alfa-sinucleína total en la superficie respecto a la superficie del ganglio. En el gráfico de la derecha, cada columna representa el número total de inclusiones de alfa-sinucleína por superficie del ganglio analizada. Conjuntamente, estos datos sugieren que la administración local de rotenona induce la fosforilación, acumulación y agregación de alfa-sinucleína junto con gliosis en los ganglios del sistema nervioso entérico. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un minuto por animal si se lleva a cabo correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante introducir la sonda de gavaje suavemente, y si se encuentra algún obstáculo, es preferible retirarla e introducirla nuevamente siguiendo estos procedimientos. Se pueden realizar otros métodos como HPLC, tinción inmunológica y análisis de imágenes. Esto permitirá analizar otras regiones, los efectos de la sustancia o incluso la presencia de la sustancia en la sangre tras su administración.

Esta técnica allanó el camino para que los neurocientíficos investigaran los efectos de las neurotoxinas ambientales sobre el sistema nervioso entérico. Después de ver este video, usted debería ser capaz de aplicar correctamente el medidor y analizar las imágenes que provienen de la inmunoquímica. No olvide que trabajar con material en descomposición puede ser extremadamente peligroso.

Por lo tanto, recomendamos el uso de guantes y mascarillas al realizar este procedimiento. El.