Microscopia intravital de la microcirculación del cerebro del ratón con una ventana craneal cerrado

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la microcirculación en el cerebro del ratón mediante microscopía intravital, lo que permite rastrear cambios dinámicos en los marcadores hemodinámicos e inflamatorios en la microcirculación pial durante períodos prolongados de tiempo. Esta técnica fue desarrollada en el Instituto de Bioingeniería de La Jolla, donde se utilizó en muchos tipos de estudios. Por ejemplo, el seguimiento de los cambios hemodinámicos durante el curso de la infección por plasmodium berghei y en el momento de la expresión de la malaria cerebral.

Esto se logra primero implantando una ventana craneal crónica dos semanas antes de los estudios de microscopía intravital. El segundo paso del procedimiento consiste en registrar la morfología general de la ventana craneal mediante una imagen digital de alta resolución a baja magnificación. El tercer paso del procedimiento es obtener imágenes de microscopía intravital utilizando iluminación convencional y fluorescente, y seleccionar sitios específicos de estudio para mediciones en línea del diámetro vascular y de la velocidad de los glóbulos rojos.

El paso final del procedimiento consiste en realizar un análisis intravital de la adhesión de leucocitos y plaquetas en los vasos pilosos mediante anticuerpos específicos marcados con fluorescencia. En definitiva, se pueden obtener resultados que muestran in vivo cambios microcirculatorios en modelos cerebrales que reflejan condiciones fisiológicas, fisiopatológicas o patológicas, a través de la microscopía intravital cerebral para establecer los cambios hemodinámicos asociados a estas condiciones. La principal ventaja de esta técnica es que observamos el cerebro en su entorno fisiológico sin exponerlo a agentes externos ni a medios artificiales; en comparación con la resonancia magnética y la angiografía por imagen, la microscopía intravital ofrece resoluciones espacial y temporal que nos permiten observar desde el nivel microscópico hasta el nivel microscópico.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la fisiología y la patofisiología de la microcirculación cerebral, como los cambios hemodinámicos e inflamatorios durante enfermedades agudas y crónicas. De dos a tres semanas antes de la microscopía intravital, se realiza una craneotomía en ratones de ocho a diez semanas de edad, como se ha demostrado previamente, excepto que no se coloca una barra de titanio en la cabeza del animal. La ventana craneal crónica es una preparación estable, que permite examinar la microcirculación pial incluso meses después de haber sido implantada, el día del experimento.

Primero, verifique la temperatura corporal del animal antes de colocarlo en un marco estereotáxico, habiendo infundido previamente eritrocitos marcados con fluorescencia a través de la vena caudal del ratón. Esto permitirá el seguimiento de eritrocitos, lo cual se demostrará más adelante. Luego, anestesie ligeramente al ratón con isoflurano.

4% para inducción, uno a 2% para mantenimiento. A continuación, coloque al animal en posición prona en un marco estereotáxico sobre una almohadilla calefactora. Sujete cuidadosamente la cabeza utilizando las barras auriculares y ajuste el nivel mediante las palancas derecha e izquierda.

Limpie suavemente la cubierta del ventanal craneal con un hisopo de algodón humedecido con aceite mineral. Luego, utilizando un microscopio estereoscópico conectado a una cámara digital, tome varias fotografías panorámicas de los vasos bajo el ventanal. Después de transferir las fotos panorámicas a una computadora, seleccione la mejor para imprimirla, identificarla y fecharla.

Esta foto se utilizará como mapa para las mediciones del diámetro del vaso y de las velocidades de los glóbulos rojos, que se demostrarán a continuación para comenzar la microscopía intravital. Transfiera el ratón a una plataforma personalizada para microscopía intravital. Coloque una gota de agua sobre la ventana craneal aprovechando el pozo formado por el acrílico dental.

Se utiliza un objetivo de inmersión en agua 20 x con una apertura numérica de 0,5. Las imágenes se registran usando dos cámaras: una cámara digital de alta velocidad y baja luminosidad conectada a una computadora y un monitor, y una cámara analógica de baja luminosidad conectada a una cinta VCR, un sello de tiempo y un monitor de color. Antes de seleccionar los vasos para la medición, revise los vasos para evaluar la calidad de la preparación y verifique si la sangre fluye por todos los vasos. Luego, seleccione los vasos que se medirán. Estos deben incluir venas y arterias de diferentes diámetros y abarcar distintas ubicaciones dentro del área expuesta por la ventana.

En nuestro experimento, seleccionamos 12 vasos para la medición mientras observa diversos campos dentro de la ventana craneal. Para seleccionar los vasos, anote la ubicación precisa de cada punto que se medirá en la imagen de la vasculatura PY que se tomó previamente. Para cada punto, el diámetro del vaso se mide utilizando un dispositivo de cizallamiento de imagen. Una vez seleccionado el punto, la imagen del vaso se alinea en posición vertical y la imagen se cizalla hasta los bordes opuestos.

Los extremos se alinean y se documenta la lectura. Para el seguimiento de eritrocitos, cada punto se registra mediante la cámara digital durante al menos 30 segundos, y las imágenes de video se graban a 150 cuadros por segundo. Esta velocidad se establece para obtener de uno a seis imágenes de una célula en un solo cuadro de video, con el fin de determinar velocidades de hasta seis milímetros por segundo.

Una vez finalizada la recopilación de datos, retire el ratón del marco estereotáxico y devuélvalo a su jaula para que se recupere de la anestesia utilizando el software adecuado. Las imágenes de video adquiridas se digitalizan y se obtienen los datos de coordenadas XY para cada imagen celular. Las posiciones celulares se determinan manualmente, en lugar de mediante análisis de imagen.

Dado que el ojo de un observador entrenado proporciona una buena estimación de la ubicación del centro de una célula, que en general corresponde al lugar de máxima fluorescencia observada. Para la mayoría de las orientaciones celulares, se determinan la posición y la velocidad en 15 células en cada vaso. Se calcula un promedio para obtener la velocidad media de los eritrocitos una vez disponibles las mediciones del diámetro del vaso y de la velocidad de los eritrocitos.

El cálculo del flujo sanguíneo en cada vaso se puede realizar utilizando la fórmula Q igual a D sobre dos al cuadrado por PI por V, donde Q equivale al flujo sanguíneo, V equivale a la velocidad de los glóbulos rojos y D equivale al diámetro del vaso, para la evaluación de la perfusión y el análisis de la adherencia de leucocitos en vasos capilares. Se realiza microscopía intravital en un animal infundido con una mezcla de albúmina marcada con FSE y anticuerpos contra el marcador pan-leucocitario CD45 marcado con Texas Red. La albúmina marcada con fluorescencia permite una mejor visualización de la red vascular, incluyendo los vasos penetrantes, y es particularmente útil en estados patológicos como la malaria cerebral para detectar vasos no perfundidos o hipoperfundidos.

Los anticuerpos anti CD 45 marcados con fluorescencia facilitan la identificación y cuantificación del rodaje y la adhesión de leucocitos a los vasos pilosos. La cuantificación de la adhesión de leucocitos se realiza contando el número de leucocitos en una longitud de vaso de 100 micrones. El rodaje se cuantifica contando el número de leucocitos que viajan a una velocidad significativamente más lenta que la velocidad sanguínea en la misma longitud de 100 micrones durante 30 segundos. Se muestra.

Aquí se muestra un ejemplo de mediciones de la velocidad de los glóbulos rojos en la microcirculación mediante el seguimiento celular a partir de fluorescencia de alta velocidad. Las grabaciones de video de las imágenes A a F son secuencias de imágenes de la microcirculación. Cada imagen representa la posición de un único glóbulo rojo en movimiento, que es capturado cuadro por cuadro mediante una cámara de alta velocidad.

Este gráfico de un experimento representativo muestra los cambios en el flujo sanguíneo del pili a lo largo del tiempo. En ratones infectados con plasmodium, burgi, onca y en ratones control no infectados, mientras que en los ratones control, el flujo sanguíneo del pili es relativamente estable a lo largo del tiempo. Los ratones infectados con PBA muestran una marcada disminución del flujo sanguíneo en el momento del desarrollo de la malaria cerebral.

En el día seis, la tinción con anticuerpos fluorescentes anti-CD45 marcados con rojo Texas revela un gran número de leucocitos adheridos a los vasos sanguíneos de un ratón infectado con Plasmodium berghei. Este procedimiento tiene una amplia gama de aplicaciones además de la tarea que se muestra aquí hoy. Cualquier técnica óptica que pueda utilizarse in vivo puede adaptarse a este modelo, y parámetros como el tejido, el nivel de oxígeno en el tejido, el pH, las especies reactivas de oxígeno y la interacción endotelial con los leucocitos pueden estudiarse en este modelo.