Un método para el 2-Photon imágenes del flujo sanguíneo en la neocorteza a través de una ventana craneal

La capacidad de obtener imágenes de la vasculatura cerebral y registrar la dinámica del flujo sanguíneo en el cerebro intacto de roedores vivos es una técnica poderosa que puede aplicarse al estudio de la isquemia cerebral o de la fisiología cerebral normal. A continuación, demostraremos cómo utilizar dos microscopías fotónicas para obtener imágenes de la dinámica del flujo sanguíneo en la neocorteza de ratones vivos mediante el uso de colorantes fluorescentes inyectados en la vena de la cola. Esta técnica fue desarrollada originalmente por David Kleinfeld en Winfred Dank.

Hola, soy Ricardo Mota del Laboratorio de Carlos Porter Cayo en el Departamento de Neurología de la Universidad de California en Los Ángeles. En un video anterior, les mostramos el método para implantar una ventana craneal para experimentos crónicos de imágenes in vivo. Hoy vamos a mostrarles el procedimiento para obtener imágenes de la dinámica del flujo sanguíneo en la corteza cerebral a través de una ventana craneal.

Esta preparación es muy útil porque permite obtener imágenes en profundidad dentro del cerebro mediante microscopía láser de dos fotones. Comencemos. Para visualizar la vasculatura cerebral, los animales deben inyectarse por vía intravenosa con un colorante fluorescente.

Utilizamos colorantes conjugados con dextrano porque el grupo dextrano evita que el colorante cruce la barrera hematoencefálica y se filtre fuera de los vasos sanguíneos. Los ratones se anestesian con isoflurano, 4 % para la inducción y entre 1,5 y 2 % durante la inyección. A continuación, se desinfecta la cola con tres torundas de alcohol al 70 %, y mediante una aguja de calibre 26, se inyectan entre 75 y 100 microlitros de una solución al 5 % de dextrano R domine disuelto en solución salina por la vena de la cola.

A mitad del eje del rabo, los animales pueden ser observados inmediatamente después de la inyección en la vena caudal hasta que el colorante sea excretado en la orina, la cual se volverá rosa si se utiliza el colorante ERO domine. Aproximadamente dos horas después de la inyección del colorante fluorescente Dexter, se anestesia al ratón con isoflurano: nuevamente, 4 % para inducción y 1 a 1,5 % para la adquisición de imágenes. El ratón se fija firmemente mediante una barra de titanio a la platina del microscopio, que contiene una almohadilla térmica regulada para mantener al animal caliente.

Se aplica una pequeña cantidad de ungüento ocular para mantener los ojos húmedos. Se limpia el cubreobjetos de la ventana craneal con alcohol al 70%. La ventana se coloca paralela al plano focal y centrada en el campo de visión.

Bajo el objetivo de 4x, lo mejor es tomar una fotografía de los vasos de la superficie cerebral con una cámara digital. Esta imagen se utilizará como referencia en las siguientes sesiones de adquisición de imágenes para localizar repetidamente la región de interés día tras día. Luego, el objetivo de 4x se sustituye por un objetivo de inmersión en agua de 40x.

Sin mover la platina, se toma la imagen digital de la vista. Nuevamente, las coordenadas del manipulador de la platina se establecen en cero. Utilizamos Scan Image como el software de adquisición de imágenes.

Esto fue escrito en MATLAB por Tom Paul Rudo y Bernardo Sabatini en el laboratorio de Carls Voto. A continuación, encendemos todos los demás equipos: el láser, el medidor de potencia, los tubos fotomultiplicadores, los amplificadores, etc. El área de la ventana adecuada para ser imagenada se escanea brevemente a baja magnificación para encontrar las mejores regiones.

Una vez identificados estos, se toma la serie de baja magnificación de la región seleccionada para obtener imágenes y se anotan sus coordenadas XY para registrar la dinámica del flujo sanguíneo en vasos pequeños o capilares. Utilizamos escaneos en línea a lo largo de al menos 40 micrones del vaso de interés. Estos barridos individuales, que duran un segundo, se realizan usando la menor potencia láser posible, y se anotan las coordenadas y el ángulo de escaneo.

Una vez finalizada la sesión de imagen, el animal se traslada a una cámara cálida donde puede recuperarse de la anestesia. Aquí mostramos una serie de cien imágenes tomadas cada cinco micrones con nuestro microscopio de dos fotones a través de una ventana craneal colocada sobre la corteza somatosensorial de un ratón de cinco meses de edad que fue inyectado con r Domine dextran mediante la vena caudal. Esta secuencia de imágenes muestra la compleja red de vasos sanguíneos grandes y pequeños, incluidos los capilares.

Acabamos de mostrarle un método para la visualización de la dinámica del flujo sanguíneo in vivo mediante una ventana craneal. Este es un método sumamente potente para obtener imágenes de la dinámica del flujo sanguíneo cerebral en la vasculatura cortical, por ejemplo, para investigar alteraciones en el flujo sanguíneo tras un accidente cerebrovascular. Se pueden realizar múltiples imágenes en diferentes momentos en BULs mediante inyecciones repetidas en la vena caudal del colorante fluorescente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar trabajar en las condiciones más limpias y estériles posibles y tener una mano muy firme. Bien, y eso es todo. Gracias por ver este video y mucha suerte con su experimento.