Determinar el número de células durante el cultivo celular utilizando el contador de células Cetro

El contador de células Scepter es un dispositivo automático portátil para contar células, monitorear el diámetro y el volumen celular, y verificar la salud y calidad de las poblaciones celulares. Ofrece ventajas significativas frente a otros métodos de conteo, incluyendo mayor precisión, facilidad de uso y bajo costo para contar células. Utilizando el Scepter, siga las instrucciones en su pantalla gráfica para aspirar las células hacia el sensor desechable.

A continuación, se cuentan las células y el dispositivo informa las concentraciones celulares y estadísticas, que pueden cargarse en una computadora y analizarse. Hola, soy Sonya. Soy científica investigadora aquí en Millport, y hoy les mostraré cómo usar el scepter.

Contar células es un paso necesario pero tedioso en el cultivo celular in vitro. Concentraciones celulares constantes garantizan la reproducibilidad y precisión experimentales. Los recuentos celulares son importantes para monitorear la salud celular y la tasa de proliferación, evaluar células inmortales o transformadas antes de su siembra para experimentos posteriores, transfección o infección, y para prepararse ante ensayos basados en células, a pesar de la necesidad de rapidez y precisión.

En el recuento de células, el 71 % de los 400 investigadores encuestados cuentan células utilizando un hemocitómetro. Aunque la hemocitometría es económica, es un proceso laborioso y está sujeto a sesgos y mal uso por parte del usuario, lo que resulta en recuentos inexactos. Las fuentes de error en la hemocitometría incluyen una distribución desigual de las células en la muestra, así como un número excesivo o insuficiente de células en la muestra.

Decisiones subjetivas sobre si una célula determinada se encuentra dentro del área definida de conteo. Contaminación del hemocitómetro, variación entre usuarios y variación en la tasa de llenado del hemocitómetro para aliviar la monotonía asociada con el conteo manual. El 29 % de los investigadores cuentan células utilizando dispositivos automatizados de conteo celular.

Sin embargo, para la mayoría de los investigadores, el precio asociado con estos grandes instrumentos de banco representa una barrera para su uso. El contador de células Scepter es un dispositivo automático portátil que ofrece la automatización y precisión del conteo Coulter a un costo relativamente bajo y en un formato portátil de fácil uso. El sistema emplea el principio Coulter de detección de partículas basado en impedancia, en un formato miniaturizado, utilizando una combinación de hardware analógico y digital para el procesamiento de señales de detección, almacenamiento de datos y visualización gráfica.

El sensor desechable está diseñado con una zona de detección celular microfabricada que permite la discriminación por tamaño celular y volumen celular con resolución submicrométrica y subpicolitro, mejorada con canales de manipulación precisa de líquidos y electrónica. El contador celular Scepter muestra gráficamente las estadísticas de la población celular en forma de histograma para su uso. El contador celular Scepter comienza diluyendo una suspensión individual de células en solución salina tamponada con fosfato.

Una concentración de 10 000 a 500 000 células por mililitro es óptima. Transfiera 100 microlitros de células diluidas a un tubo microvisor de 1,5 mililitros. Encienda el contador de células Scepter presionando y manteniendo pulsado el interruptor en la parte trasera del instrumento y espere a que aparezcan las instrucciones en pantalla.

Cuando se le indique, sujete un sensor al extremo de la unidad del cilindro, con el panel sensor del electrodo orientado hacia la parte frontal del instrumento. Los sensores Scepter consisten en una cámara de muestreo moldeada con precisión que incluye una zona sensora electrónica y electrodos integrados para la detección celular. Estos sensores permiten discriminar el tamaño celular con resolución submicrométrica y el volumen celular con resolución subpicolitro.

Una ingeniería de sensores constante garantiza que se cuenten volúmenes de muestra iguales y que se realicen mediciones precisas de tamaño. Una vez que el sensor esté conectado, realice cada paso del proceso de conteo según las instrucciones en pantalla de la siguiente manera. Cuando la pantalla indique, mantenga presionado el émbolo para comenzar a presionarlo; luego, la pantalla mostrará sumerja el sensor, sumerja el sensor en la solución de suspensión celular y suelte el émbolo para aspirar la suspensión celular hacia el sensor.

El émbolo actúa como una señal eléctrica y aspirará la muestra junto con el volumen muerto hacia el sensor. La velocidad o precisión del movimiento del émbolo no es relevante, a diferencia de lo que ocurre con la pipeta. Este proceso tardará varios segundos cuando esté listo.

El instrumento emitirá un sonido y en la pantalla se mostrará la muestra cargada. Una vez que la muestra se carga en el sensor, esta es aspirada a través de la zona de detección para evaluar el tamaño celular y el volumen celular. Luego, a través de los microcanales, cuando se han contado 50 microlitros de muestra, el sensor indica al instrumento que detenga el conteo.

Una vez finalizada la cuenta, la pantalla del instrumento indicará que la cuenta ha finalizado. Retire el sensor y deséchelo. Siga la indicación y retire, luego deseche, el sensor.

El instrumento mostrará entonces un histograma del tamaño o diámetro celular en su pantalla, así como la concentración celular por mililitro. Una vez que el conteo esté completo y el histograma se muestre en el instrumento, aplique compuertas pulsando el botón de alternancia, seleccione la compuerta automática o use la anterior para establecer automáticamente la compuerta según el perfil del histograma o para utilizar las compuertas del conteo previo. Independientemente de la selección, las compuertas pueden ajustarse manualmente para afinarlas.

Ajuste los datos, presione nuevamente el botón de alternancia para seleccionar la compuerta izquierda y deslice el control para mover la compuerta según desee. Luego, presione el botón de alternancia nuevamente para activar la compuerta derecha y deslice el control para colocar la compuerta derecha. Haga clic nuevamente.

Se mostrará una nueva concentración celular, volumen celular promedio y diámetro. El interruptor también puede moverse hacia cualquier lado para alternar la visualización entre fecha y hora, tamaño medio de la célula y volumen medio de la célula; hasta 72 histogramas pueden almacenarse en el instrumento mismo. Para cargar los datos en una computadora personal, conecte el instrumento mediante el puerto del cable USB, en la pantalla de visualización de la PC.

Haga doble clic en la aplicación de software scepter para iniciar el software. Luego haga clic en conectar. Todos los conteos se transferirán automáticamente al software.

El software de aplicación scepter muestra el histograma que detalla la distribución poblacional de la cultura en volumen o diámetro. Los archivos descargados pueden exportarse luego a Microsoft Excel, donde los datos brutos se mostrarán en intervalos de diámetros celulares o volúmenes celulares especificados. Se prepararon 19 líneas celulares diferentes para el recuento, y las concentraciones iniciales teóricas se determinaron utilizando un contador de cultivos.

Estas suspensiones celulares se diluyeron posteriormente para obtener suspensiones celulares con concentraciones celulares teóricas. Luego se utilizó el contador celular Scepter para determinar las concentraciones celulares. Esta figura muestra cinco diluciones que se midieron para cinco líneas celulares representativas junto con la concentración celular teórica.

El alto grado de linealidad, indicado por los valores de r cuadrado, demuestra que el conteo con scepter es un método confiable para las líneas celulares evaluadas en un amplio rango lineal de funcionamiento. La precisión relativa general del conteo con scepter se muestra aquí, en donde los datos obtenidos mediante el conteo con scepter se comparan con los conteos obtenidos mediante el conteo con coter. Se grafica el logaritmo de los conteos celulares con scepter frente al logaritmo de los conteos con coter, lo cual muestra que, en todas las líneas celulares evaluadas, los conteos con scepter coinciden con los conteos con coter.

Se realizaron recuentos de 19 líneas celulares utilizando un contador Coulter Z two. El contador celular Scepter, un contador automatizado basado en visión, como el sistema V cell o count test, y los recuentos hemo TER se llevaron a cabo según las instrucciones del fabricante, utilizando la misma suspensión inicial de células y diluciones idénticas. Los resultados mostrados en esta figura demuestran que las concentraciones celulares medidas mediante el recuento con Scepter coinciden estrechamente con las concentraciones celulares teóricas, con alta linealidad.

Se calculó el coeficiente de variación porcentual o CV para cada dilución de cada línea celular. Para cada sistema de recuento mostrado, aquí se presentan los CV porcentuales promedio sobre 19 líneas celulares con respecto a la concentración celular y al método de recuento dentro del rango de operación. El contador de células Scepter es más preciso que el recuento con hemocitómetro, mostrando desviaciones estándar menores y coeficientes de variación promedio más reducidos.

El conteo con Scepter es 10 veces más rápido que la hemocitometría y también más rápido que otros contadores automatizados. Aquí se contaron células SF nine, MCF seven y HC 2 93 utilizando los métodos descritos en este video. Se registró el tiempo promedio necesario para medir la concentración celular.

Tenga en cuenta que la citometría hemática se realizó solo una vez por muestra. Scepter realiza mediciones basadas en el tamaño celular. Por lo tanto, cualquier cambio en la morfología celular puede registrarse en el histograma.

Los cultivos sanos muestran una distribución gaussiana en forma de campana bien definida, mientras que las células no viables mueren y provocan un desplazamiento del histograma hacia la izquierda. De manera similar, cuando se mezcló una población con 50 % de células muertas con 50 % de células vivas, también se observaron desplazamientos en el histograma. Acabo de mostrarle cómo utilizar el nuevo contador de células Scepter de Millipore, que está revolucionando la forma en que los investigadores cuentan sus células.