Visualización de intermediarios de replicación inducidos por UV en E. coli Con dos dimensiones-gel de agarosa Análisis

El objetivo general de este procedimiento es visualizar los intermediarios estructurales del ADN que se producen cuando la replicación encuentra lesiones en el ADN, mediante el uso de un análisis en gel bidimensional. Esto se logra primero aislado el ADN de células en división activa en las cuales se han inducido lesiones que bloquean la replicación. Luego, se utiliza la electroforesis en gel para separar el ADN recuperado según su tamaño.

A continuación, se cortan las bandas y se recolocan horizontalmente en un segundo gel que separa aún más el ADN según su tamaño y forma. Finalmente, se utiliza el análisis Southern para visualizar las estructuras de ADN asociadas con fragmentos de ADN en replicación en momentos anteriores y en diversos momentos posteriores a la introducción de daños inducidos por UV. En última instancia, este procedimiento puede utilizarse para demostrar que la incapacidad de procesar lesiones en el ADN en ciertos mutantes provoca la acumulación de intermediarios de reparación del ADN.

Hola, mi nombre es Arthur Ian. Soy del Laboratorio Corella de la Universidad Estatal de Portland. Hola, mi nombre es Brand she, yo también soy del Laboratorio Corella.

Hoy les mostraremos un procedimiento para la electroforesis en gel bidimensional. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los intermediarios de la replicación y reparación del ADN. Así que comencemos.

Para comenzar este procedimiento, cultive una cultura sobrenocturna de 200 microlitros de e coli que contenga el plásmido PBR 3 22 en medio DGC thigh con ampicilina a 37 grados Celsius. El uso del medio DGC thigh minimiza la protección contra la UV. Tras la incubación sobrenocturna, pelletice las células a 14,000 RRP M durante 30 segundos.

Luego, resuspenda el sedimento celular en 200 microlitros de medio DG C th sin ampicilina e inocule. Cultive 20 mililitros de medio DG C th sin selección con ampicilina. Incube en un incubador con agitación a 37 grados Celsius hasta alcanzar una DO600 de 0,5, lo que corresponde aproximadamente a cinco veces 10 a la octava células por mililitro. El crecimiento sin ampicilina evita la selección en contra de intermediarios de replicación anormales o no productivos que podrían surgir en algunos mutantes.

Además, si se utiliza luz UV para inducir daño, es necesario eliminar la ampicilina del medio porque absorbe fuertemente a estas longitudes de onda y actúa como escudo, reduciendo la dosis efectiva de UV mientras las células crecen. Utilice un fotómetro UVC para determinar la distancia desde una lámpara germicida de 15 vatios que produzca una tasa de exposición de aproximadamente un JUUL por metro cuadrado por segundo.

Los pasos subsiguientes deben realizarse bajo luz amarilla, ya que esto evitará la reversión por fotoactivación de los dímeros de ciclobutano en las bases pirimídicas mediante la fotoliasa después de la irradiación con UV. Una vez alcanzada la densidad celular deseada, utilice una pipeta para transferir el cultivo a una placa de Petri de 15 centímetros de diámetro colocada sobre una plataforma rotatoria, con el fin de asegurar una irradiación uniforme de toda la población celular. A continuación, irradie los cultivos con 50 joules por metro cuadrado e inmediatamente transfiéralos a un matraz estéril previamente calentado y colóquelos de nuevo en el incubador a 37 grados Celsius con agitación.

Durante toda la duración del experimento, esta dosis produce en promedio un dímero de ciclobutano por cada 4,5 kilobases de ADN de cadena sencilla, por cada punto temporal que se vaya a examinar. Pipetee un alícuota de 0,75 mililitros de la cultura en 0,75 mililitros de NET 30 frío con hielo. El tampón NET 30 sirve como tampón de parada que impide que continúen la replicación y la reparación por escisión de nucleótidos.

Una vez que se haya agregado el tampón de parada, la muestra puede mantenerse en hielo hasta el final del curso temporal. Después del curso temporal, centrifugue cada muestra y resuspenda los pellets. En 150 microlitros de tampón de lisis, lise las células a 37 grados Celsius durante 20 minutos sin agitación.

Dado que las estructuras replicativas con regiones de cadena sencilla o puntos de ramificación son más susceptibles al cizallamiento, corte las puntas de las pipetas con una cuchilla de afeitar para agrandar la boca y minimizar las fuerzas de cizallamiento. En general, se debe mantener al mínimo la pipetación y la agitación hasta después de que el ADN haya sido digerido con enzimas de restricción; tras la lisis, agregue proteinasa K y célula sarcosina y permita que la incubación continúe durante una hora. Esto sirve para liberar fragmentos de ADN asociados con proteínas.

Dado que el ADN en replicación activa a menudo se encuentra unido a complejos de proteínas o membranas, esto ayuda a aumentar el rendimiento de los fragmentos de replicación. Después de una hora, extraiga las muestras añadiendo dos volúmenes de fenol a cada muestra e invirtiendo suavemente los tubos durante cinco minutos. A continuación, añada dos volúmenes de cloroformo, alcohol isoamílico, e invierta suavemente los tubos durante cinco minutos adicionales.

A continuación, centrifugue las muestras a 14.000 RPM en una microcentrífuga durante cinco minutos y transfiera la fase acuosa superior de cada muestra a un tubo nuevo. Luego agregue cuatro volúmenes de alcohol ISO con cloroformo e invierta suavemente los tubos durante cinco minutos. Vuelva a centrifugar las muestras a 14.000 RPM durante cinco minutos.

Coloque una membrana de diálisis sobre 250 mililitros de 0,1 xte en un vaso de precipitados y aplique 100 microlitros de cada muestra sobre la membrana. Deje que las muestras se dialicen durante una hora tras la diálisis. Coloque 80 microlitros de cada muestra en un tubo fresco de 1,5 mililitros que contenga 20 microlitros de mezcla enzimática.

Digiera las muestras durante la noche a 37 grados Celsius. PV dos linealiza el plásmido justo aguas abajo del origen de replicación. Antes de cargar el gel de agarosa, agregue 100 microlitros de cloroformo y 20 microlitros de colorante de carga seis x que contiene bromo.

Fenol azul y xileno cianol a cada muestra y mezcle cloroformo eliminará cualquier PV dos restante unido a los extremos del ADN. Comience el análisis en gel de agarosa bidimensional realizando la corrida de las muestras de ADN digeridas a través de la primera dimensión. Primero cargue un marcador de tamaño Lambda Hind tres en la primera hendidura de un gel de agarosa 0,4 % previamente preparado en 1X TBE.

Luego cargue 40 microlitros de la fase acuosa que contiene el colorante de carga para cada muestra, omitiendo pozos para facilitar el corte del gel. Tras la electroforesis, realice la primera dimensión a un voltio por centímetro durante aproximadamente 12 a 15 horas. El voltaje bajo y el gel de AGROS de bajo porcentaje sirven para separar los fragmentos de ADN principalmente según su tamaño.

Después de que haya corrido la primera dimensión, utilice un cuchillo grande de carnicero para recortar la primera banda que contiene el marcador Lambda Hind III y tiña con bromuro de etidio. Para la segunda dimensión, corte las bandas del gel usando el cuchillo grande de carnicero y el marcador Lambda Hind III como guía de corte, y deseche la región inferior donde se espera que migre el plásmido linealizado en cada banda. Para moldear la segunda dimensión, coloque cada trozo horizontalmente a lo largo del borde superior de un molde para geles vacío.

Prepare una solución de 1 % AROS en un XTBE y enfríe a 55 grados Celsius. Una vez enfriada, vierta la solución de gel para verter la segunda dimensión, asegurándose de cubrir completamente las rebanadas de gel. Es importante garantizar que las rebanadas estén orientadas uniformemente y que el molde esté nivelado antes de verter el gel.

Una vez que el gel haya solidificado, realice la segunda dimensión durante cinco horas y media a siete horas a 6,5 volúmenes por centímetro en una unidad de electroforesis que permita la recirculación del tampón; el gel de agarosa de alto voltaje y alto porcentaje separa eficazmente los fragmentos de ADN según su forma y también según su tamaño. Las formas no lineales migran más lentamente a través de la segunda dimensión tras la electroforesis. Enjuague el gel una vez con agua y luego lávelo dos veces en 400 mililitros de ácido clorhídrico 0,25 molar durante 15 minutos con agitación suave.

Los lavados ácidos sirven para romper parcialmente las moléculas de ADN en fragmentos más pequeños que se transfieren de manera más eficiente durante el análisis southern, y son necesarios debido al gran tamaño y la forma inusual de los intermediarios de la replicación del ADN. Para preparar el gel para la transferencia alcalina, enjuague nuevamente el gel con agua y luego lávelo dos veces en 400 mililitros de hidróxido de sodio 0,4 molar durante 30 minutos. El ADN presente en los geles se transfiere entonces a una membrana de nylon de alto enlace n plus mediante un sistema de transferencia alcalina descendente con hidróxido de sodio 0,4 molar, como se describe en la parte escrita de este procedimiento; permita que la transferencia del ADN continúe durante seis a doce horas. Tras la transferencia del ADN, continúe con la hibridación de la sonda según lo indicado en el protocolo escrito.

Una vez que la membrana haya sido incubada con la sonda y lavada, coloque la membrana sobre una toalla de papel hasta que el líquido haya desaparecido visiblemente. A continuación, envuelva la membrana en una envoltura de plástico de cloruro de polivinilo y expóngala a una pantalla de imagen fosforescente. Finalmente, la radiactividad puede visualizarse y cuantificarse utilizando un Storm 840 y su software de cuantificación de imágenes asociado.

Se diagrama el patrón de migración de la PV dos del plásmido PBR 3 22 digerido observado mediante análisis en gel de arcos 2D. Los plásmidos lineales no replicantes se desplazan como un fragmento lineal de 4,4 KB; los plásmidos replicantes forman estructuras en forma de Y que migran más lentamente que los fragmentos no replicantes debido a su mayor tamaño y forma no lineal. Este patrón de migración forma un arco que se extiende desde la región lineal hacia el pozo tras la irradiación con UV.

Se observan moléculas con forma de doble Y o X en la región del cono y migran más lentamente que el arco de moléculas con forma de Y. Se muestra un ejemplo del análisis southern en geles 2D sonda con PBR 32 marcado con P 32 en células inmediatamente después de la irradiación con UV y a los 15 minutos posteriores a la irradiación con UV inmediatamente después de la irradiación con UV. Aproximadamente el 1 % del ADN plasmático total puede encontrarse en el arco de Y cuando las células crecen rápidamente en fase exponencial tras una radiación.

Se observa un aumento transitorio de moléculas en forma de YS cuando se acumulan horquillas de replicación bloqueadas en sitios dañados. Los intermediarios de replicación en forma de L también se acumulan temporalmente y persisten hasta un momento que se correlaciona con la reparación de las lesiones. Acabamos de mostrarle cómo visualizar intermediarios de reparación del ADN utilizando electroforesis en gel bidimensional.

Al realizar este procedimiento, es importante tener en cuenta las fuerzas de cizallamiento que pueden reducir el rendimiento y tratar con delicadeza todas las muestras y geles. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.