Los potenciales de membrana, las respuestas sinápticas, circuitos neuronales, neuromodulación y la histología muscular utilizando el cangrejo de río: Los ejercicios de laboratorio para estudiantes

Los objetivos generales de los siguientes experimentos son comprender las propiedades de las membranas excitables y la base iónica del potencial de membrana en reposo, así como aprender métodos para medir el potencial de membrana y demostrar las propiedades de la transmisión sináptica. En una parte del experimento, se medirá el potencial de membrana en reposo mientras se altera el potasio extracelular. En otra parte del experimento, se investigarán los mecanismos de diferenciación sináptica mediante el registro de respuestas sinápticas estimuladas en diversas unidades motoras.

A continuación, se presenta un circuito neuronal que es fácil de mantener. Este preparado puede utilizarse tanto para la enseñanza como para investigar diversos aspectos de un circuito sensorial hacia el SNC, hacia la neurona motora y hacia el músculo. Este conjunto de experimentos muestra la facilidad de usar el modelo del cangrejo de río para abordar cuestiones relacionadas con la integración y transmisión del potencial de membrana, y las diferencias estructurales de los tipos de fibras musculares.

Las principales ventajas del uso de la preparación de cangrejo de río para enseñar conceptos y técnicas de electrofisiología son la facilidad de disección, la viabilidad de la preparación con salino mínimo, la facilidad para obtener respuestas sinápticas y la facilidad para discernir la disposición anatómica general de los músculos. Estas técnicas también pueden aplicarse a otras preparaciones y ampliarán nuestro entendimiento de la fisiología y modulación sináptica, así como de las diferencias bioquímicas y estructurales en la preparación demostrada. Para comenzar la cirugía, seleccione un cangrejo de río de aproximadamente seis a diez centímetros de longitud corporal y colóquelo en hielo triturado durante cinco minutos para anestesiarlo; para decapitar al cangrejo de río, sosténgalo desde la parte posterior de la cabeza, asegurándose de mantener los dedos fuera del alcance de las pinzas y la boca del animal utilizando tijeras grandes.

Retire rápidamente la cabeza realizando un corte limpio detrás de los ojos del cangrejo de río, y elimine las patas y pinzas del cangrejo de río para evitar lesiones. Retire los estilos en los machos y las natadoras tanto en machos como en hembras. Deseche la cabeza y las apéndices.

A continuación, separe el abdomen del tórax realizando un corte a lo largo de la membrana articular que une el abdomen y el tórax. Guarde la porción abdominal del cangrejo de río y deseche el tórax; dirija las tijeras ligeramente hacia abajo, en dirección al lado ventral y en ángulo, y realice un corte en el caparazón a lo largo del borde lateral inferior de cada lado del abdomen. Tenga cuidado de no cortar demasiado profundamente dentro del cangrejo de río.

Siga el patrón natural de las líneas del caparazón del cangrejo de río que recorren la longitud de cada segmento usando pinzas. Retire la porción ventral del caparazón tirando de ella hacia arriba y hacia atrás, teniendo cuidado de no dañar los músculos abdominales.

Retire los músculos flexores. En este punto, se puede observar una masa blanca de tejido encima de los músculos flexores profundos. Retire este tejido cuidadosamente con pinzas.

El tracto gastrointestinal es ahora visible como un pequeño tubo que recorre la línea media de los músculos flexores profundos. Retírelo pellizcándolo con pinzas en la parte superior y tirando de él hacia fuera del abdomen. Corte la parte inferior del tracto gastrointestinal al final de la cola.

Lave la disección con solución salina para asegurarse de que los desechos fecales no interfieran con la preparación. Usando alfileres de disección, sujete las esquinas superior e inferior de la preparación a una placa de Petri recubierta con S guard. Ahora quedan expuestos los músculos extensores abdominales.

Vierta solución salina en la placa de Petri para cubrir la preparación hasta que se realicen las grabaciones intracelulares. Mueva la placa de Petri al microscopio y utilice cera debajo del recipiente para evitar que se mueva. El aparato utilizado para las grabaciones intracelulares se muestra en esta figura.

Las conexiones y configuraciones adecuadas se indican en el texto adjunto. Configure el software de registro de laboratorio según las instrucciones. En el texto adjunto, coloque el cable de tierra en el baño de solución salina.

Coloque la punta de una micropipeta de vidrio llena con cloruro de potasio tres molar en el baño salino y pruebe la resistencia del electrodo. La resistencia del electrodo debe estar entre 20 y 60 megaohmios. Utilice el mando grueso del amplificador para mover la línea en el gráfico del laboratorio a cero bajo iluminación de alta intensidad.

Observe a través del microscopio e identifique los músculos DEM longitudinales. Utilice la sonda del electrodo para insertar el electrodo intracelular en una fibra muscular del músculo DEM. El electrodo debe insertarse apenas en la fibra muscular.

Tenga cuidado de no penetrar completamente la célula. Mida la amplitud del potencial de reposo. Arrastre el cursor M hacia la traza desde la ubicación en la esquina inferior izquierda de la ventana del gráfico.

Coloque el marcador M sobre la línea base y mueva el cursor al punto más bajo de la señal registrada. La diferencia entre el marcador y el cursor activo se muestra en la parte superior derecha de la pantalla. Este valor es el voltaje del potencial de membrana en reposo.

Divida el voltaje registrado por la cantidad de amplificación; en este caso, se utilizó una amplificación de 10 veces. Luego, convierta el voltaje de voltios a milivoltios. Después de registrar el potencial de reposo de esa fibra muscular, observe a través del microscopio y retire cuidadosamente el electrodo de la fibra muscular.

Repita la grabación intracelular en otras fibras musculares. La siguiente parte de este experimento monitoreará el efecto del aumento de la concentración extracelular de potasio sobre la membrana en reposo. Se utilizarán seis soluciones salinas de cangrejo con concentraciones de potasio de 5,4, 20, 40, 60, 80 y 100 milimolares.

Seleccione un músculo que no esté temblando para realizar el siguiente registro intracelular entre grabaciones. Reemplace la solución del baño con la siguiente concentración más alta de solución de cloruro de potasio. Asegúrese de cubrir completamente la preparación cada vez.

Registre los cambios en el potencial de membrana para cada solución. El efecto del aumento de la concentración extracelular de potasio, el potencial de membrana se muestra en esta gráfica capturada en pantalla con los potenciales de membrana en reposo para cada concentración de potasio en una gráfica semilogarítmica de la concentración extracelular de potasio frente al potencial de membrana. Alinee el potencial en reposo a una concentración extracelular de potasio de 5,4 milimolares.

Para las curvas hipotéticas y observadas, compare la pendiente de la línea observada con la pendiente de la línea hipotética. Después de finalizar estos registros electrofisiológicos, el siguiente paso consiste en examinar la anatomía de las fibras musculares y su patrón de inervación. Transfiera la preparación al recipiente de pie y agregue azul de metileno.

Después de cinco minutos, retire el azul de metileno y agregue solución salina fresca para cangrejo de río. Busque el nervio principal que inerva los músculos dentro de un segmento. Dibuje el patrón de inervación hacia los músculos S-E-M-D-E-L 2D EL uno y DEM en un segmento.

A continuación, traslade la preparación debajo de una campana extractora. Retire la solución salina y agregue el fijador. El fijador utilizado aquí es una solución poin.

El propósito de la campana extractora es evitar los vapores del fijador. Tenga mucho cuidado de no salpicar esta solución sobre la piel ni en los ojos. Si sus ojos comienzan a arder, lávese los ojos inmediatamente en la estación de lavado ocular.

Deje que la solución de boína permanezca sobre el preparado durante aproximadamente 10 minutos, y luego use una pipeta para cambiar la solución por suero salino. Corte un segmento delgado del músculo DEL uno o DEL dos. Colóquelo sobre un portaobjetos de vidrio.

Etiquete el portaobjetos. Repita el procedimiento para el músculo SEM. Utilice el microscopio compuesto para observar el patrón de bandas del sarcómero en ambas preparaciones de tejido.

La siguiente serie de experimentos examinará cómo registrar respuestas sinápticas en los músculos abdominales de cangrejo de río. Seleccione otro cangrejo de río y depréndele la cabeza. Retire el tórax y las apéndices, y exponga los músculos extensores abdominales como se muestra en la cirugía.

En la primera sección de este video, utilizando el microscopio, localice el nervio que transporta los axones motores hacia los músculos extensores. Busque el segmento con el nervio más accesible. El nervio es blanco y puede observarse rociando solución salina sobre la preparación con una pipeta o soplando suavemente sobre la preparación.

Esto hace que el nervio se mueva y, por lo tanto, facilita su identificación. Coloque el electrodo de succión sostenido por el micromanipulador directamente sobre el nervio. Tire suavemente del émbolo de la jeringa para introducir el nervio en el electrodo.

Puede observarse cómo el nervio es succionado hacia el electrodo a través del microscopio. Ajuste la configuración en el software del registrador según se especifica en el artículo adjunto. Llene un microelectrodo de vidrio con cloruro de potasio tres molar y conéctelo al cabezal y al equipo PowerLab.

Utilice el mando grueso del amplificador para mover la línea en el gráfico del laboratorio hasta cero. Antes de insertar el electrodo, el botón conmutador debe activarse y desactivarse varias veces. Con el fin de probar la resistencia del electrodo, mida la amplitud de los valores resultantes.

Observe a través del microscopio y utilice la sonda del electrodo para insertar el electrodo en una de las fibras musculares longitudinales, ya sea DEM o DL uno o DL dos. Tenga cuidado de no atravesar la fibra muscular. La preparación ya está lista para el experimento.

El electrodo de succión se utiliza para estimular el haz nervioso segmentario y el microelectrodo de vidrio se utiliza para registrar la respuesta sináptica de la fibra muscular, activando el estimulador de injerto para estimular el nervio a un hercio para obtener respuestas fásicas. A continuación, coloque el electrodo en una fibra muscular SEL. El SEL es un músculo tónico.

Estimule el nervio con ráfagas cortas de pulsos a 10 hercios para obtener respuestas tónicas. Compare las respuestas registradas de los músculos DEL y SEL. Observe que los músculos fásicos DEL presentan respuestas sinápticas de mayor amplitud que los músculos tónicos SEL.

Este siguiente conjunto de experimentos se centra en los músculos flexores del cangrejo de río en lugar de los músculos extensores. Comenzando con un cangrejo de río nuevo, aísle el abdomen tal como se muestra en esta cirugía. En la primera sección de este video, coloque la preparación aislada de la cola en una placa de Petri llena de solución salina, sujete con alfileres la cola y la porción superior de la preparación.

Téngase en cuenta que en los experimentos de decar Caro sobre los músculos flexores tónicos, debe dejarse intacto el cordón nervioso ventral. Utilice un escalpelo para iniciar un corte longitudinal a través de la membrana articular entre dos costillas en el lado ventral de la preparación. Tenga mucho cuidado de no cortar demasiado profundo al realizar este corte, ya que un corte profundo podría seccionar la raíz del nervio motor y asegúrese de que los músculos superficiales no resulten dañados.

Realice el siguiente paso. Observando a través de un microscopio, corte horizontalmente con tijeras o un escalpelo desde el corte longitudinal en la capa delgada de membrana que recubre el músculo. Amplíe el corte para crear una solapa de membrana articular y levante la solapa hacia arriba.

Utilice tijeras para cortar la aleta y exponer los músculos flexores superficiales para la grabación intracelular de los músculos flexores superficiales. Utilice el mismo instrumental y configuración que se usaron para registrar el potencial de membrana en reposo y las respuestas sinápticas de los extensores abdominales. Como antes, use un electrodo intracelular lleno con cloruro de potasio tres molar.

Introduzca el electrodo en una fibra muscular de los músculos flexores superficiales, teniendo cuidado de no atravesar el músculo. Registre la actividad espontánea de los PEPS. Observe los diferentes tamaños de los PEPS y si hay presencia de PPIS.

Tome un pincel pequeño y pase cuidadosamente a lo largo del borde de la cutícula dentro del mismo segmento que contiene el electrodo de registro. Observe cualquier cambio en la frecuencia o tamaño de los PEPS debido a la estimulación si se observa una respuesta mayor. Esto indicaría la reclutación de neuronas motoras adicionales que responden al cambio en la actividad de disparo del nervio sensorial.

Cambie cuidadosamente la solución salina del baño por una que contenga un neuromodulador, como serotonina de un micromolar o salina burbujeada con dióxido de carbono. Luego repita la estimulación con el pincel. Observe el efecto que tiene el cambio de la solución del baño sobre la actividad registrada.

Cambie la salina del baño de nuevo a salina normal y observe que la actividad de la fibra muscular regresa al nivel basal. Esta figura muestra potenciales postsinápticos excitadores registrados en una fibra muscular flexora superficial. Observe los diferentes tamaños de los potenciales postsinápticos excitadores.

La siguiente etapa de este experimento utiliza un electrodo extracelular para monitorear los potenciales de acción de las neuronas motoras que responden a la actividad en el circuito desde las neuronas sensoriales hasta el SNC y luego a las neuronas motoras. Comience fabricando un electrodo de succión para estimular los nervios sensoriales. Pase un trozo de tubo plástico sobre una llama.

El siguiente paso consiste en recortar el tubo hasta el tamaño deseado. Para ello, deberá observar el nervio en su preparación para determinar el diámetro de apertura deseado para su electrodo de succión. Dependiendo del tamaño del cangrejo de río, los haces nerviosos pueden variar en tamaño desde aproximadamente un milímetro hasta varios milímetros de diámetro.

Corte la sección estirada del tubo para que la abertura en la punta tenga el tamaño adecuado para sostener el nervio. Si la abertura es demasiado grande, el nervio podría salirse. Si la abertura es demasiado pequeña, el nervio podría dañarse por la presión del electrodo.

Coloque el tubo de plástico en la punta de un electrodo de vidrio para SAC. La configuración de electrofisiología y software es ligeramente diferente para la monitorización de respuestas extracelulares en comparación con la configuración para grabaciones intracelulares. Utilizando el equipo especificado en el artículo adjunto, aspire la tercera rama que inerva el músculo flexor superficial dentro del electrodo de succión.

Ahora puede comenzar a registrar potenciales de acción. Esta vía tiene cinco neuronas motoras excitadoras y una neurona motora inhibitoria. Después de registrar la actividad basal, estimule la cutícula con un pincel para observar el cambio en los potenciales de acción generados.

A continuación, sustituya la solución del baño por neuromoduladores como la serotonina, tal como en el experimento anterior, y registre cualquier cambio en la respuesta. En el texto adjunto se proponen ejercicios adicionales. Esta grabación muestra los potenciales de acción registrados desde la tercera vía antes y durante la estimulación de la cutícula con un cepillo; compare la frecuencia de los potenciales de acción antes del cepillado con su frecuencia durante la estimulación.

Esta grabación muestra los potenciales de acción registrados desde la tercera ruta en solución salina normal y en una solución de serotonina. Compare la frecuencia de los potenciales de acción en solución salina normal con su frecuencia en serotonina, como se acaba de mostrar. El cepillado aumenta la frecuencia de disparo respecto a la línea base.

También se demuestra que la serotonina aumenta la frecuencia de disparo en comparación con la solución salina normal. Esta figura muestra que cuando se combinan el cepillado y la serotonina, se produce un aumento aún mayor en la frecuencia de disparo. La comparación entre los efectos externos y teóricos de la concentración de potasio externo sobre el potencial de membrana en reposo indica la influencia de los iones sobre el potencial de membrana.

También le hemos mostrado cómo registrar respuestas ntic en las uniones neuromusculares de músculos fásicos y tónicos. Estas técnicas pueden utilizarse en laboratorios estudiantiles de investigación para enseñar conceptos y fisiología fundamentales. Las técnicas adquiridas en este ejercicio de laboratorio pueden emplearse para responder preguntas relacionadas con otras preparaciones de laboratorio, así como aplicaciones fisiológicas vinculadas a la medicina y la salud.