La experimentación fisiológica con el intestino grueso cangrejo de río: Un ejercicio de laboratorio los estudiantes

El objetivo general de este informe es servir como herramienta didáctica para estudiantes de último año de secundaria y universitarios en cursos de fisiología que participen en experimentación fisiológica. Los estudiantes aprenden a exponer y registrar las contracciones en el intestino posterior de cangrejo de río. Un paso adicional consiste en extirpar el intestino posterior del animal, lo que permite la aplicación directa de compuestos.

A continuación, se monitorea la fuerza y el ritmo de las contracciones del músculo liso del intestino posterior mientras se aplican diversos agentes farmacológicos para examinar los mecanismos que alteran la intensidad de la contracción. Se obtienen resultados que muestran la acción de moduladores sobre la inervación neural o directamente sobre el músculo, basados en ensayos farmacológicos y subtipificación de receptores. Hola, soy el Dr. J. Mercier del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Brock.

He estado utilizando el intestino posterior de cangrejo de río como preparación para realizar investigaciones sobre neurotransmisores que controlan los músculos viscerales. También he estado usando esta preparación como herramienta didáctica y, como parte de una colaboración con el laboratorio del Dr. Robin Cooper en la Universidad de Kentucky, estamos perfeccionando una serie de experimentos dirigidos por estudiantes con fines educativos. Este método puede proporcionar información sobre la función del intestino posterior de cangrejo de río.

También puede aplicarse en estudios de enfermedades como aquellas que implican ritmos peristálticos. Asimismo, puede utilizarse para describir los mecanismos que subyacen a la modulación de la musculatura y la inervación neural. Los estudiantes aprenderán a interpretar datos fisiológicos y farmacológicos mediante el uso de agentes farmacológicos, neurotransmisores y neurohormonas, y adquirirán una comprensión general de la función de los receptores.

Con respecto a agonistas y antagonistas, los estudiantes construirán curvas de respuesta a la dosis y presentarán los datos en forma gráfica para su análisis estadístico. Para anestesiar al animal, coloque un cangrejo de río de seis a 10 centímetros de longitud corporal sobre hielo durante cinco a 10 minutos. Sujete el cangrejo de río anestesiado por detrás de las pinzas con una mano. Corte rápidamente desde la cuenca del ojo hasta la mitad de la cabeza en ambos lados, y luego separe la cabeza del cangrejo de río.

La sangre de la preparación será pegajosa cuando se manipule, por lo tanto lave las herramientas al finalizar. A continuación, corte las patas y las garras. Luego, retire las aletas caudales izquierda y derecha, dejando la aleta caudal media, y corte a lo largo del lado dorsal del abdomen hasta llegar al último segmento.

Luego corte a lo largo del último segmento y hacia abajo por el otro lado. Retire la concha dorsal. Coloque el cangrejo de río diseccionado en la placa de Petri forrada con papel de cigarrillo.

Solución salina deficiente para cangrejos de río. Para cubrir la preparación, utilice alfileres de disección para fijarla al recipiente de Petri. Por lo general, el intestino posterior está rodeado por una masa de vasos sanguíneos y tejido conectivo.

Retírelos con pinzas, teniendo cuidado de no dañar el intestino. Ahora el intestino posterior es visible a lo largo del abdomen.

Deje que la preparación de cangrejo de río diseccionado repose en la solución salina durante aproximadamente 10 minutos para que pueda recuperarse del shock provocado por la disección y la exposición a la salina. Observe las contracciones peristálticas lentas del intestino posterior. Para comenzar, ahora se puede calcular la frecuencia de las contracciones.

Cuente el número de contracciones que ocurren en 30 segundos y regístrelo en un registro. También registre el tipo de contracciones que ocurren y si son peristálticas o espásticas. Observe la dirección de las ondas peristálticas.

Contar la frecuencia de contracciones cerca del ano y a la mitad del abdomen, y verificar si existen diferencias en la frecuencia entre estas dos regiones. Tener preparadas diversas soluciones de prueba y mantenerlas a la misma temperatura que la solución salina de baño. La primera solución que se probará aquí será serotonina de un micromolar preparada en solución salina para cangrejo de río.

Utilizando una pipeta, retire la solución salina de la cavidad del abdomen expuesto del cangrejo de río y aplique directamente la solución de serotonina de un micromolar sobre el intestino posterior. Inmediatamente después de añadir la nueva solución, espere 30 segundos y luego cuente las contracciones durante 30 segundos en la región cercana al ano, y a continuación cuente las contracciones durante los siguientes 30 segundos en la parte media del abdomen. Registre estos valores en una tabla y anote también el tipo de contracciones que ocurren. Siguiente.

Vierta la solución de prueba desde el recipiente de registro y enjuague varias veces el intestino posterior con solución salina normal para cangrejo de río. Luego, enjuague la preparación cada 30 segundos durante cinco minutos. En este momento, puede añadir la siguiente solución de prueba, que en esta demostración es una micromolar de Topamina.

Registre sus observaciones como antes y repita este proceso para el resto de los compuestos de prueba. Al utilizar múltiples concentraciones de la misma sustancia, asegúrese de comenzar con la concentración más baja y avanzar hacia concentraciones más altas. El montaje para medir la fuerza de las contracciones del intestino incluye una computadora portátil con el software Lab Chart 7, el Bridge Pod, el Power Lab 26 T y el transductor de fuerza.

Antes de poder medir la fuerza de las contracciones musculares del tracto gastrointestinal, es necesario aislar el tracto gastrointestinal. Para lograrlo, corte los músculos del último segmento abdominal, coloque dos o más alfileres a través de la cutícula ventral blanda a ambos lados del ano, luego retire el resto del abdomen, dejando el intestino posterior y el ano unidos a un pequeño fragmento de cutícula. El intestino debe seccionarse cerca de la unión entre el tórax y el abdomen.

Ahora mueva el tracto gastrointestinal a un recipiente poco profundo con el fondo recubierto de sard. Hay un vaso sanguíneo que recorre el aspecto dorsal del tracto gastrointestinal. Retírelo cuidadosamente del tracto gastrointestinal.

Vierta salino fresco de cangrejo sobre el preparado. Desplace el transductor de fuerza hacia el preparado. Observe cuidadosamente el alfiler que está pegado en la parte inferior del transductor de fuerza.

El extremo que se engancha al intestino tiene una pequeña curva. Enganche la curva pequeña del alfiler al extremo cortado del intestino posterior. Después de enganchar el intestino posterior, mueva ligeramente el recipiente hasta que el intestino posterior quede tenso.

Tenga cuidado con este paso, ya que el intestino debe estar tenso, pero no demasiado apretado. Un apriete excesivo podría dañar el músculo. Cuando el platillo esté en la posición óptima, utilice cera o arcilla para mantenerlo firme.

A continuación, inicie el software. Para comenzar la grabación, abra el software de registro de laboratorio. Cierre el registro de laboratorio y el centro de bienvenida.

Vaya a la configuración en la esquina superior izquierda. Haga clic en la configuración del canal en la esquina inferior izquierda. Cambie la configuración del canal para que tenga solo un canal.

Haga clic en aceptar en el lado derecho de la pantalla. Vaya al canal uno, abra el módulo de puente. Establezca el rango en la configuración más sensible, 200 microvoltios en este caso, en la parte superior de la gráfica en la esquina derecha.

Configure los ciclos por segundo en 2K. Ahora está listo para grabar. Haga clic en iniciar para asegurarse de que la configuración funcione correctamente.

Toque ligeramente la punta del transductor con una pipeta. Debería observar un cambio en la fuerza registrada por el software. Haga clic en detener en el software, luego haga clic en iniciar y deje que el programa se ejecute.

Durante aproximadamente 20 segundos, haga clic en detener y agregue un comentario etiquetado como solución salina. Calcule únicamente la frecuencia de las contracciones midiendo el tiempo desde el inicio de una desviación hasta el inicio de la siguiente, o contando el número total de desviaciones durante un minuto o dos. Calcule la frecuencia en contracciones por minuto o en contracciones por segundo, según la rapidez con que ocurran.

Para medir la fuerza de las contracciones, utilice una medida relativa para comparar las contracciones bajo diferentes condiciones en el archivo guardado. Mueva el marcador M hasta la línea de base, luego mueva el cursor hasta el pico de la desviación y anote el valor indicado en la parte superior derecha de la pantalla. Este es un valor delta que representa la diferencia entre M y el pico.

Tenga en cuenta que el cursor debe mantenerse estacionario en el pico para medir el cambio. Luego, mueva el marcador M y el cursor a la siguiente forma de onda de interés y repita la medición para examinar el efecto de los moduladores. En esta preparación, cambie lentamente la solución salina a una solución de prueba.

En este caso, añada un micromolar de serotonina y continúe registrando la frecuencia y la fuerza de las contracciones como última prueba. Para esta preparación, compruebe si los inhibidores de las uniones en hendidura modifican la frecuencia o la fuerza de las contracciones; los inhibidores de las uniones en hendidura incluyen etanol al 1 % o solución salina que ha sido burbujeada con dióxido de carbono. Estos compuestos se utilizan al final, ya que podrían dañar las fibras musculares tras una exposición prolongada. Para comparar el efecto de los diversos compuestos, represente los datos en una gráfica.

Otro uso interesante de esta preparación es registrar la fuerza generada por los músculos circulares. Sin embargo, si aplicó inhibidores de las uniones en hendidura a su preparación, es posible que los inhibidores hayan dañado los músculos circulares, en cuyo caso debe utilizar una preparación fresca del intestino posterior para probar los músculos circulares. Para exponer los músculos circulares, haga un corte longitudinal en el tubo del intestino con tijeras finas.

Utilice alfileres finos para fijar firmemente un lado al recipiente. Conecte el alfiler con gancho del transductor al otro lado de la tira. Exponga la preparación a los mismos compuestos que se probaron en los músculos longitudinales; la relación entre los compuestos probados y el número y tipo de contracciones se muestra aquí.

Puede graficar el número de contracciones frente al tiempo para las soluciones de suero salino, serotonina y glutamato. Puede graficar el número de contracciones frente a la fuerza de las contracciones en milivoltios para las soluciones de suero salino, serotonina y glutamato. Estos gráficos pueden realizarse tanto para los músculos longitudinales como para los circulares, con el fin de comprobar si los músculos longitudinales y circulares en las distintas regiones del intestino presentan respuestas diferentes frente a los diversos moduladores.

Los experimentos anteriores pueden repetirse en diferentes regiones desde el ano hacia arriba a lo largo del abdomen. Al realizar este procedimiento, es importante recordar tener cuidado de no dañar el tracto gastrointestinal con las pinzas y de no tirar con demasiada fuerza con el transductor de fuerza tras seguir este procedimiento. Otros métodos, como grabaciones electrofisiológicas del músculo, pueden realizarse para abordar otros aspectos, tales como las funciones y modulaciones de los canales iónicos, y que pueden servir como modelo para otros tejidos en otros modelos animales.