Una pantalla de alto rendimiento para Biominería actividad de celulasa de bibliotecas metagenómicas

El objetivo general de este procedimiento es identificar clones que expresen celulasa a partir de una biblioteca metagenómica. Esto se logra primero replicando una biblioteca metagenómica previamente construida mediante el uso de un robot, seguido de la incubación de la biblioteca replicada a 37 grados Celsius durante 24 horas. Se mide el crecimiento de los clones de E. coli, y luego se añaden buffer de lisis y sustrato a la biblioteca replicada.

Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la actividad de celulasa mediante mediciones colorimétricas de absorbancia usando un lector de placas. Hola, soy Keith del laboratorio de Steven Hallam en el Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Columbia Británica. Hoy les mostraremos un procedimiento para la selección funcional de alto rendimiento de bibliotecas metagenómicas.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la actividad de la celulasa biomin a partir de bibliotecas metagenómicas. Así que comencemos. Antes de iniciar este protocolo, prepare una biblioteca metagenómica almacenada en formato de placa de 384 pocillos.

Este estudio utilizó el vector de control de una copia PCC SMID junto con células de e coli EPI 300 T uno resistente TRANSFECT max Farge T uno resistente como huésped de la biblioteca para iniciar este procedimiento; retire las placas que contienen la biblioteca de menos 80 grados Celsius y deshiélelas a 37 grados Celsius durante aproximadamente 20 minutos. Mientras tanto, utilice la función de esterilización con luz UV en el QIX dos para esterilizar el robot durante 15 minutos. Configure el Q fill tres según las instrucciones del fabricante con la botella de medio conectada al colector mediante el programa de tubo estéril.

El Q fill three se llena con la cantidad adecuada de medio y se ajusta para dispensar un volumen de 45 microlitros. En cada pozo, purgar el aire de los tubos y del manifold utilizando la función de purga del robot hasta que sea visible el medio. En cada pin del manifold, llenar el número deseado de placas con medio LB utilizando el Q fill three.

Cada placa tarda aproximadamente 20 segundos en llenarse. A continuación, cargue las placas de biblioteca y las placas nuevas en las áreas correspondientes de las Q picks. Para llenar robotizadamente las cubetas de limpieza con los reactivos adecuados.

2 %micro 90 en el baño trasero, agua destilada en autoclave en el baño central y etanol al 80 % en el baño delantero. Utilizando el programa de replicación del qix two, seleccione la cabeza adecuada, así como el número y tipos de placas de origen y destino. Además, configure la cabeza para que se limpie entre replicaciones.

Normalmente, seis ciclos en cada baño son suficientes. La capacidad de la máquina es de 10 placas a la vez. Configure la máquina para que funcione.

Se necesitarán aproximadamente 15 minutos para replicarlo. Capacidad máxima con una cabeza de 384 clavijas. Una vez replicadas las placas, incubarlas a 37 grados Celsius durante 24 horas en una caja de humedad.

El tiempo prolongado de incubación es necesario ya que se está induciendo un número elevado de copias de smid mediante la adición de arabinosa. Mientras tanto, limpie el robot Q fill three según se describe en el protocolo escrito. Tras la incubación, retire las placas del incubador a 37 grados Celsius.

Coloque las tapas aparte y sitúe las placas sobre la plataforma de carga del magazine proporcionada con el apilador rápido. Asegúrese de llevar un control del orden de las placas, ya que el software no lo hace. Se leerán las placas que se encuentren en la parte inferior de la pila.

Primero, retire una revista de la pila rápida. Asegúrese de que esté vacía y colóquela en la pila de placas que se van a leer. Tome la reviesta por la empuñadura y la placa debería cargarse en la revista.

Coloque la revista en el cargador rápido en la orientación correcta. Abra el programa de escaneo en el ordenador conectado. Seleccione una nueva sesión y asígnele un nombre adecuado.

Seleccione una placa de 384 pocillos con fondo plano como placa. Escriba en el área de diseño de la placa. Seleccione el botón del asistente y elija agregar 384 muestras desconocidas a la placa.

En el área del protocolo, seleccione la opción de bucle de pocillo e ingrese para 384 pocillos. Un icono de bucle de pocillo aparecerá en el árbol de flujo en el lado izquierdo de la pantalla. Seleccione el icono y haga clic para agregar la medición fotométrica.

Configúrelo para leer a 600 nanómetros. Guarde el protocolo con un nombre único y cierre el programa de escaneo. Luego abra el programa Polara RS.

En la página principal hay una tabla que enumra los instrumentos conectados al dispositivo de apilamiento rápido bajo el encabezado VARI scan; haga clic en la opción ejecutar sesión. Luego debería aparecer la ventana del ensayo con un diagrama de flujo en el centro. Seleccione el elemento ejecutar sesión y luego busque el nombre del escaneo guardado.

Su reinicio en el menú desplegable que aparece en el lado derecho de la pantalla. Una vez seleccionado el protocolo, haga clic en ejecutar. En este ensayo, aparecerá un cuadro preguntando qué cartucho utilizar como fuente y cuál cartucho está vacío.

El cuadro inferior de la pantalla corresponde a la revista frontal. Asegúrese de que tanto la pila rápida como el escaneo Vario estén encendidos y haga clic en iniciar. La pila rápida cargará automáticamente las placas en el lector de placas, lo que permitirá mediciones continuas de las placas.

Observe la carga del primer plato en el escaneo Vario para asegurar una alineación adecuada de las máquinas para la lectura. Escanear 25 platos toma aproximadamente 50 minutos. Una vez que finalice el escaneo de Barrios, retire el magazine completo y colóquelo en la plataforma de carga del magazine.

Levante el rectángulo exterior de la plataforma y la revista debería deslizarse, dejando las placas de pie en una pila en el centro. Finalmente, coloque las tapas nuevamente sobre las placas para una prueba basada en solución. Para la actividad de celulosa primero, prepare la mezcla de ensayo utilizando un stock previamente hecho 10 veces concentrado de lisis.

Mezcle con tampón de acetato de potasio 50 milimolar a pH 5,5 según se describe en el protocolo escrito. Luego, prepare un stock de hasta 75 miligramos por mililitro de sustrato cromogénico DIPHENYL o DNP biocida celular en DMSO, asegurándose de que el sustrato se disuelva completamente. Añada la solución stock de biocida celular DNP a la mezcla de ensayo hasta alcanzar una concentración final de 0,1 miligramos por mililitro.

Tenga en cuenta que cada placa utiliza aproximadamente 20 mililitros de solución y se necesitan 50 mililitros adicionales para permitir el volumen muerto. Configure la Q fill three como antes, añadiendo la mezcla de ensayo a cada placa utilizando la Q fill three. Cada placa tarda aproximadamente 20 segundos en llenarse.

Una vez añadida la mezcla de ensayo, incubar las placas a 37 grados Celsius durante 12 a 16 horas. En una caja de humedad, retirar las placas del incubador a 37 grados Celsius. Dejar las tapas aparte y colocar las placas sobre la plataforma de carga del magazine suministrada con el apilador rápido, de la misma manera que antes.

Abra el programa de escaneo y configúrelo como se hizo anteriormente, con la excepción de la medición fotométrica, que debe establecerse para leer a 400 nanómetros. Luego ingrese los parámetros en el programa POLARA RS, como se demostró anteriormente.

Permita que el escáner Vario lea las placas. Tras la corrida, retire y deseche las placas. Para exportar las lecturas de absorbancia, abra el software de escaneo y seleccione.

Abra un archivo existente. Seleccione el directorio donde se guardó la sesión y pulse el icono de más para expandir la lista. Bajo el encabezado del título aparecerán opciones etiquetadas como contenedor uno hasta contenedor N. Dependiendo del número de placas, seleccione la primera placa que se analizará en la barra de menú en la parte superior de la página y luego seleccione exportar informe de datos.

Seleccione las opciones de exportación, como el diseño de la placa y los datos fotométricos. Haga clic en ver informe y luego en guardar archivo. Elija el directorio deseado.

El formato de salida es una hoja de cálculo de Microsoft Excel. Aquí, las lecturas de absorbancia de una sola placa de 384 pocillos que contiene un clon positivo, como se muestra, indican que los clones positivos presentan un aumento notable en la absorbancia en comparación con los clones que no expresan actividad celulasa.

Las diferencias en el tiempo de ensayo, el pocillo, la ubicación en la placa o la concentración de DNP pueden afectar las lecturas absolutas de absorbancia. Las lecturas relativas de absorbancia, como la diferencia de absorbancia por encima del promedio de la placa o del promedio de la columna, son un método más robusto para identificar clones positivos para celulasa. Acabamos de mostrarle cómo identificar clones positivos para celulasa a partir de una biblioteca metagenómica.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar disolver su DNP cell bio side en DMSO e incubar sus placas en una cámara de humedad. Eso es todo. Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.