La interferencia de ARN en las garrapatas

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la técnica de interferencia de ARN en garrapatas mediante inyección. Esto se logra primero sintetizando ARN de doble cadena del gen o genes de interés. Luego, el ARN se inyecta en las garrapatas, las cuales se mantienen posteriormente en una cámara de humedad durante 24 horas.

Después de este período de mantenimiento, se permite que las garrapatas se alimenten de un animal como una oveja. Se determinan parámetros de alimentación tales como peso, muda y posición de los huevos, así como la expresión del gen o genes diana mediante R-T-P-C-R en tiempo real. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran el efecto del silenciamiento de los genes diana sobre la biología de las garrapatas, mediante la evaluación de parámetros biológicos de las garrapatas y la expresión génica por R-T-P-C-R en tiempo real.

Nuestro grupo trabaja con garrapatas, tratando de caracterizar los eventos moleculares en la interfaz garrapata-patógeno para utilizar esta información básica en el desarrollo de métodos para el control de la infestación por garrapatas y la transmisión de patógenos a humanos y animales. La interferencia de ARN ha surgido como una herramienta esencial en esta investigación, ya que es el único método disponible para la manipulación genética de las garrapatas. La función de muchos genes de las garrapatas es desconocida.

La interferencia de ARN permite definir el papel de los genes de las garrapatas y la expresión génica en muchos aspectos de la biología de las garrapatas, incluyendo el apareamiento, la reproducción, la alimentación, la digestión, la función de las glándulas salivales y la competencia vectorial de las garrapatas para la transmisión de patógenos. El procedimiento será demostrado por el equipo de interferencia de ARN en garrapatas de nuestro laboratorio, el Dr. Ed Lewin, el estudiante de posgrado Busby y yo mismo. Para generar ARN de doble cadena, primero sintetice cebadores oligonucleotídicos que contengan secuencias promotoras de T siete para la transcripción in vitro de ARN.

Por ejemplo, lesión variable del centro dérmico. Utilice los cebadores de oligonucleótidos D ocho A a T 75 y D ocho DVT 73 mostrados aquí. Amplifique el gen diana mediante R-T-P-C-R utilizando 10 picomoles de cada cebador de oligonucleótido y de 1 a 10 nanogramos de ARN total de garrapata.

A continuación, purifique el producto de PCR. Luego utilice ocho microlitros o aproximadamente 100 nanogramos para sintetizar ARN de doble cadena. Para preparar las garrapatas para la inyección, primero lave las garrapatas en la siguiente serie de soluciones: agua del grifo, peróxido de hidrógeno al 3%, agua destilada dos veces, etanol al 70% y dos lavados finales con agua destilada.

Realice cada lavado en un tubo desechable de centrífuga de 50 mililitros agitando. Luego vierta la solución a través de una malla fina de alambre. Deje secar las garrapatas sobre toallas de papel y, a continuación, divídjalas en alícuotas de grupos de 20 a 50, según el experimento.

Coloque cada grupo en un vaso plástico de 1,25 onzas con tapa ajustada y etiquete cada vaso con el grupo experimental. A continuación, forme un equipo de ARNi compuesto por tres personas que llevarán a cabo el proceso de inyección. La primera persona coloca cada garrapata sobre cinta adhesiva doble adherida a una hoja de cera dental roja de tres por seis pulgadas.

La segunda persona inyecta las garrapatas y la tercera monitorea las garrapatas después de la inyección, sopla dióxido de carbono sobre ellas para activarlas, cuenta y transfiere las garrapatas vivas a vasos etiquetados con el número del grupo experimental. Todos los miembros del equipo deben usar guantes desechables. Para comenzar el proceso de inyección de garrapatas, capture una garrapata utilizando pinzas finas Dumont y colóquela con el lado ventral hacia arriba sobre cinta adhesiva doble colocada sobre una lámina de cera dental roja. Posicione las garrapatas en grupos de cinco. Coloque una pequeña tira de cinta adhesiva sobre las piezas bucales de las cinco garrapatas.

Con el fin de restringirlos aún más, deje expuesta la mayor parte del cuerpo para que el inyector de garrapatas pueda observar el proceso de inyección. Para inyectar la garrapata, perfore un orificio en el cuadrante inferior derecho de la superficie ventral del exoesqueleto utilizando una jeringa de insulina mono-eject con una aguja de 29 gauge y media pulgada. A continuación, inyecte inmediatamente a las garrapatas entre 0,2 y 0,5 microlitros de solución de ARN bicatenario utilizando una jeringa Hamilton modificada y una aguja de 33 gauge de una pulgada con punta biselada de 45 grados; coloque bien la aguja dentro de la cavidad de la garrapata para asegurar la colocación y retención del ARN bicatenario.

Aunque se libere líquido tras la inyección, colocar profundamente la aguja durante la inyección garantizará que se deposite suficiente ARN bicatenario en la cavidad de la garrapata para inducir el silenciamiento génico; debe tenerse cuidado de no excederse. Inyecte las garrapatas, ya que esto provocará pérdida de hemolinfa y muerte de la garrapata. Inmediatamente después de inyectarlas, levántelas del adhesivo doble con pinzas finas y colóquelas en un recipiente plástico de recuperación.

Las garrapatas permanecerán inactivas brevemente después de la inyección, pero pronto deberían comenzar a moverse por el recipiente. Active las garrapatas soplando dióxido de carbono sobre ellas. Una vez que las garrapatas estén moviéndose y activas, la herida de inyección sanará rápidamente y es muy probable que sobrevivan.

Cuente las garrapatas en cada grupo experimental y coloque cada grupo en un vaso plástico etiquetado con una tapa ajustada herméticamente. Reemplace cualquier garrapata que muera en el grupo actual antes de inyectar el siguiente grupo experimental. Limpie la jeringa Hamilton antes de inyectar el siguiente grupo experimental llenando y luego expulsando la jeringa con peróxido de hidrógeno al 3% fresco.

15 veces seguido de 15 lavados con agua estéril. Tenga cuidado de no doblar el émbolo de la jeringa Hamilton, de lo contrario el émbolo no se moverá suavemente ni responderá al tacto suave necesario para la inyección en garrapatas. Después de la inyección, coloque las garrapatas en una cámara con un recipiente lleno de agua y sulfato de potasio, lo cual mantiene una alta humedad y las conserva durante un día.

A continuación, coloque garrapatas individuales en celdas de alimentación fijadas a un cordero y permita que se alimenten junto con un número igual de garrapatas macho o hembra no inyectadas, según el sexo que no haya sido inyectado. Recolecte y retire las garrapatas hembra de la celda de alimentación tras completar la alimentación, aproximadamente a los 10 días o cuando las hembras control hayan abandonado al hospedador. Incube cada grupo de garrapatas en una cámara de humedad hasta la finalización de la oviposición. Evalúe la oviposición por grupo pesando la masa de huevos producida por todas las garrapatas de un grupo, con el fin de evaluar el fenotipo de las garrapatas tras la alimentación.

Determine el número de garrapatas que sobrevivieron y calcule el peso de las garrapatas, así como la posición de los óvulos y la fertilidad de los huevos. Dependiendo del gen objetivo y los objetivos del estudio, se pueden realizar otros análisis para confirmar el silenciamiento génico mediante R-T-P-C-R. Después de la alimentación, diseque las glándulas salivales y los intestinos de garrapatas individuales de los grupos inyectados con control y con ARN bicatenario, y luego extraiga el ARN total de las muestras individuales de tejido.

Analice los transcritos del gen diana en tejidos individuales mediante R-T-P-C-R en tiempo real y normalice los niveles de ARN frente al ARN ribosómico 16 s de la garrapata. Utilizando el método gene norm, realice curvas de disociación al final de la reacción para asegurar que se forme un único amplicón y que los amplicones se desnaturalicen consistentemente en el mismo rango de temperatura para cada muestra; compare los valores de CT normalizados para los niveles de ARNm entre las garrapatas inyectadas con control y las inyectadas con ARN bicatenario utilizando la prueba t de Student.

El protocolo descrito aquí se ha utilizado en nuestro laboratorio para ARNi en muchas especies diferentes de garrapatas exóticas. La cantidad de ARN bicatenario inyectado en las garrapatas varía según el tamaño de la garrapata. Las especies de garrapatas más grandes pueden alojar un volumen mayor.

Las referencias se pueden encontrar en la sección escrita que acompaña el protocolo. Si el protocolo se realiza correctamente, se debería obtener una mortalidad inferior al 5 % tras el procedimiento de inyección después de 24 horas. Aquí se muestra un fenotipo típico tras la inhibición génica en garrapatas, en el que un grupo de garrapatas fue inyectado con mezclas de ARN bicatenario que se utilizaron para tamizar antígenos protectores de garrapatas.

En garrapatas examinadas mediante microscopía óptica, puede observarse degeneración celular en los tejidos de las garrapatas. Los cambios fenotípicos también pueden ir acompañados de pérdida de función. Por ejemplo, el ARNi de SUBIN produce machos estériles que no pueden aparearse con éxito con las hembras tras la interferencia del ARN y las garrapatas.

Se pueden utilizar otros métodos para determinar el impacto del silenciamiento génico en la expresión génica y proteica y en la biología de las garrapatas, incluyendo R-T-P-C-R en tiempo real, microscopía electrónica de transmisión, microscopía confocal, genómica o proteómica. La interferencia por ARN también se puede realizar en cultivos celulares de garrapatas y proporciona un método in vitro para el estudio de las interacciones entre patógenos y células de garrapatas.