Seguimiento de los cambios dinámicos en niveles de calcio mitocondrial de la apoptosis mediante un sensor de calcio genéticamente codificados
1 de abril de 2011
Este protocolo describe un método para la medición en tiempo real de los flujos de calcio mitocondrial de imagen fluorescente. El método se aprovecha de una circular permutaciones YFP basada en sensor de calcio de doble excitación radiométrica (radiométrica pericam-mt) expresa selectivamente en las mitocondrias.
El objetivo general de este procedimiento es monitorear los cambios en la concentración de calcio mitocondrial en células vivas. Esto se logra primero transfectando las células con la proteína indicadora de calcio peram métrico de razón, dirigida a la matriz mitocondrial, uno o dos días después de la transfección. El microscopio de fluorescencia y el software se configuran para la obtención de imágenes en células vivas.
Posteriormente, se adquieren imágenes de células expresando el peramétrico de razón tras la adición de un agonista movilizador del calcio. El paso final del procedimiento es el análisis cuantitativo de las imágenes adquiridas. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren cambios dinámicos en la concentración mitocondrial de calcio mediante microscopía de fluorescencia de células vivas que expresan una proteína indicadora de calcio con relación métrica.
La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la medición de los niveles de calcio mediante indicadores sintéticos de calcio, es que el peram métrico está codificado genéticamente y, por lo tanto, puede dirigirse a las mitocondrias o a cualquier otro orgánulo de interés. Hola, soy el Dr. Ascar, investigador posdoctoral en el laboratorio del Dr. Benning, y hoy demostraré el procedimiento. Para comenzar el protocolo, siembre células HeLa la noche anterior a la transfección sobre cubreobjetos de vidrio estériles colocados en una placa de cultivo estándar de seis pocillos, a una densidad que al día siguiente será aproximadamente del 70 % de confluencia para la transfección. Al día siguiente, prepare complejos de ADN con Lipofectamina 2000 según las instrucciones del fabricante, utilizando cuatro microgramos del vector de expresión mitocondrial de peram métrico y 10 microlitros de Lipofectamina 2000 diluidos en 0.5 mililitros de Opti-MEM para cada pocillo a transfectar.
A continuación, sustituya el medio de cultivo D-M-E-M-F-B-S HELOC en cada pocillo con 1,5 mililitros del mismo medio sin antibióticos. Añada la solución LIPECTOMY a la solución de ADN y mezcle suavemente después de que se hayan formado los complejos. Añada la solución de ADN Lipectomy gota a gota a cada pocillo que se va a transfectar, mezclando mediante un suave movimiento de balanceo de la placa, e incube durante cuatro horas en un incubador de cultivo celular a 37 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono, tras la incubación.
Sustituya el medio por D-M-E-M-F-B-S que contenga antibióticos. Deje que las células expresen metric peram durante uno o dos días antes de la adquisición de imágenes utilizando pinzas. Coloque suavemente un cubreobjetos con células HELOC en una cámara de imagenación adecuada con solución de imagenación.
Coloque la cámara de imagen en el portaobjetos de un microscopio invertido. A continuación, utilice un objetivo de inmersión en aceite de 40 x o superior y una longitud de onda de 380 nanómetros. Para encontrar un área de interés que contenga una o más células que expresen peram métrico, se utiliza aquí 380 nanómetros para identificar las células como métricas.
Peram es menos resistente al fotoblanqueo a esta longitud de onda. Una vez identificada un área de interés, configure el software para excitación dual a 495 y 380 nanómetros. A continuación, adquiera imágenes secuencialmente excitando alternativamente a 495 y 380 nanómetros.
Adquiera imágenes de los niveles basales de calcio durante al menos 30 segundos antes de la aplicación del agonista. Luego, aplique el agonista movilizador de calcio mediante un aparato de perfusión, anotando el momento de adición; los tiempos de exposición al agonista y los intervalos de adquisición deben optimizarse para prevenir el fotoblanqueo, al tiempo que permiten una resolución temporal suficiente. Una vez finalizado el experimento, las imágenes pueden analizarse fuera de línea.
Para comenzar el análisis, seleccione una región de interés dentro de un área vacía del campo para restar la fluorescencia de fondo si es necesario. A continuación, exporte las mediciones de la relación 4 95 3 80 de la región de interés a Excel o a un software gráfico similar. Este panel de imágenes muestra la localización subcelular del peram métrico de relación y las mitocondrias.
A la izquierda se muestra una imagen de células vivas de células HeLa que expresan peramétrico de razón. En el centro, la tinción fluorescente de las mitocondrias con el colorante selectivo MitoTracker Red CMXRos. Finalmente, a la derecha, la imagen fusionada que se muestra aquí es una serie de imágenes de razón en pseudocolor de 495 y 380 nanómetros de cuatro células HeLa que expresan peramétrico de razón en las mitocondrias, tratadas con 10 micromolar de ATP; y la cuantificación de los cambios en los niveles mitocondriales de calcio de esas cuatro células previas se muestra aquí en esta imagen de una célula HeLa que expresa peramétrico de razón en las mitocondrias.
La heterogeneidad de la respuesta de calcio en mitocondrias individuales, así como una fragmentación mitocondrial significativa, es evidente a los 60 minutos de tratamiento con 0,5 micromolar de estorsporina. Algunas mitocondrias presentan aumentos oscilatorios de calcio, indicados con la flecha blanca, mientras que otras no muestran cambios significativos en los niveles de calcio, indicados con una flecha amarilla. Este gráfico revela el cambio en los niveles mitocondriales globales de calcio en una sola célula HELO tras la inducción de apoptosis durante 120 minutos con 0,5 micromolar de estorsporina.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir los cambios dinámicos en los niveles de calcio mitocondrial en respuesta a diversos tli utilizando la proteína mediadora de calcio R geometric peram, que se dirige selectivamente a la matriz mitocondrial.
Descripción general
Este protocolo describe un método para la medición en tiempo real de los flujos de calcio mitocondrial mediante un indicador de calcio codificado genéticamente, el pericam-ratiométrico-mt. Esta técnica permite el monitoreo dinámico de los niveles de calcio en células vivas, proporcionando información sobre la función mitocondrial.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Imagen de fluorescencia
Antecedentes
- Los niveles de calcio mitocondrial son cruciales para el metabolismo celular y la señalización.
- Los métodos tradicionales para medir los niveles de calcio suelen basarse en indicadores sintéticos.
- Los indicadores codificados genéticamente ofrecen ventajas en especificidad y direccionamiento.
- Este estudio utiliza el pericam-mt con relación de intensidades para mejorar la visualización de la dinámica del calcio mitocondrial.
Objetivo del estudio
- Monitorear los cambios en la concentración de calcio mitocondrial en células vivas.
- Mostrar el uso de un indicador genéticamente codificado de calcio dirigido a las mitocondrias.
- Proporcionar un protocolo detallado para la adquisición de imágenes y el análisis de los flujos de calcio mitocondrial.
Métodos Utilizados
- Transfección de células con pericam-mt ratiométrico.
- Imagenología de células vivas mediante microscopía de fluorescencia.
- Excitación secuencial a longitudes de onda duales para la medición de calcio.
- Análisis cuantitativo de imágenes de fluorescencia para evaluar la dinámica del calcio.
Resultados principales
- Se midieron con éxito los cambios dinámicos en los niveles de calcio mitocondrial.
- Se observó heterogeneidad en las respuestas de calcio entre mitocondrias individuales.
- Se observó una fragmentación significativa de las mitocondrias bajo ciertos tratamientos.
- Los resultados demostraron la eficacia del pericam-mt ratiométrico para la imagen en tiempo real.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para estudiar la dinámica del calcio mitocondrial.
- Los indicadores codificados genéticamente, como el pericam-ratiométrico-mt, mejoran las capacidades de imagen.
- Esta técnica puede aplicarse a diversas condiciones experimentales para investigar la función mitocondrial.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El monitoreo de la dinámica del calcio mitocondrial proporciona información mecanicista esencial sobre las vías de apoptosis, permitiendo la validación de dianas en los mecanismos de muerte celular. Este enfoque con sensores codificados genéticamente respalda la confianza predictiva en modelos preclínicos al cuantificar flujos de calcio específicos de orgánulos con resolución temporal. El método facilita la reducción temprana de riesgos en hipótesis terapéuticas que involucran disfunción mitocondrial en modelos de enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar el calcio mitocondrial como regulador de las vías apoptóticas para la comprobación de hipótesis específicas.
- Valor operativo: Proporciona lecturas específicas de orgánulos que reducen la ambigüedad en estudios mecanicistas de la muerte celular.
- Valor predictivo: Facilita la validación funcional de dianas implicadas en la apoptosis mediada por calcio mediante mediciones en tiempo real de flujos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera datos cuantitativos ratiométricos que permiten el análisis de respuesta a la dosis de compuestos que afectan el calcio mitocondrial.
- Valor operativo: Compatible con microscopía de campo amplio estándar, lo que permite su integración en plataformas de imagen existentes sin necesidad de equipo especializado.
- Valor de escalabilidad: Permite el seguimiento longitudinal de la dinámica de calcio y de la morfología mitocondrial en células vivas durante horas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Relaciona los cambios en el calcio mitocondrial con resultados apoptóticos, respaldando la relevancia de biomarcadores en modelos de enfermedades.
- Valor operativo: Demuestra utilidad tanto con ATP (agonista fisiológico) como con estaurasporina (inductor de apoptosis), ampliando la aplicabilidad en diversas condiciones experimentales.
- Continuidad traslacional: Facilita el paso del descubrimiento del mecanismo a la validación preclínica al proporcionar lecturas dinámicas y fisiológicamente relevantes.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la reducción del riesgo mecanicista y la evaluación preclínica, al proporcionar datos dinámicos y cuantificables sobre la función mitocondrial.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre vías apoptóticas dependientes del calcio mediante mediciones en tiempo real del flujo mitocondrial.
- Tamizaje: Permite sistemas listos para ensayos con lecturas estandarizadas y reproducibles de calcio para campañas de tamizaje de compuestos.
- Análisis: Proporciona resultados cuantitativos ratiométricos (relación de excitación 495 nm/380 nm) que permiten comparaciones estadísticas de la dinámica del calcio entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Relaciona los cambios en el calcio mitocondrial con fenotipos apoptóticos, favoreciendo la continuidad desde el mecanismo hasta el resultado fenotípico.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de imagenología reutilizable para estudiar la disfunción mitocondrial en múltiples áreas de enfermedades.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías de apoptosis.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante indicadores genéticamente codificados y dirigidos a orgánulos que evitan la fuga de colorantes y los artefactos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar información cuantitativa temprana sobre los mecanismos mitocondriales de acción de los compuestos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en perfiles de modulación del calcio mitocondrial.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología molecular para la transfección y el microscopio de células vivas.
- Depende de microscopía de fluorescencia con capacidad de doble excitación (380 nm y 495 nm) y conjuntos estándar de filtros.
- Necesita la estandarización de los protocolos de adquisición de imágenes y del análisis de regiones de interés entre diferentes equipos.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la eficiencia de direccionamiento mitocondrial y los posibles artefactos por sobreexpresión en distintos modelos celulares.
- Las limitaciones prácticas incluyen los riesgos de fotodesvanecimiento durante imágenes a largo plazo y la necesidad de optimizar los intervalos de exposición al agonista.
