La detección de modificaciones post-traduccionales de los nativos intactos nucleosomas por ELISA

El objetivo general de este procedimiento es determinar con precisión los niveles relativos de modificaciones postraduccionales dentro de preparaciones de nucleosomas celulares totales obtenidos a partir de un millón de células. Esto se logra primero preparando cultivos homogéneos de alta calidad de células de mamífero. Luego, los núcleos se aíslan de las células mediante la ruptura mecánica con un homogenizador Dounce y centrifugación.

El siguiente paso consiste en obtener nucleosomas intactos digiriendo la cromatina presente dentro de los núcleos y realizando una serie de extracciones hipotónicas. Por último, los nucleosomas se analizan mediante un ensayo ELIZA con los controles apropiados para identificar modificaciones postraduccionales específicas. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren los niveles relativos de modificaciones específicas presentes en las muestras de nucleosomas.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el inmunoblot y la inmunoprecipitación de cromatina es que puede determinarse fácilmente una imagen global de varios estados de modificación de nucleosomas. El método es mucho más sensible y preciso que el inmunoblot y puede realizarse en la mayoría de los laboratorios equipados para experimentación general en biología molecular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre y la epigenética, como qué ocurre cuando tienen lugar eventos importantes de diferenciación y reprogramación.

Para comenzar el procedimiento, primero tripsinice las células con tres mililitros de tripsina por placa de 15 centímetros para obtener células recién tripsinizadas. Añada 20 mililitros de PBS frío con butirato. Transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros y centrifugue el tubo para recoger las células a 1000 RPM durante cinco minutos, aspire el sobrenadante y añada 10 mililitros de PBS frío con butirato para lavar; luego centrifugue nuevamente la suspensión celular a 1000 RPM durante cinco minutos.

Elimine el sobrenadante y resuspenda el botón celular en cuatro mililitros de tampón de lisis con inhibidores de proteasas, como se describe en el protocolo escrito. A continuación, aspire las células con una pipeta y transfiera a un homogenizador con pistilo tipo B, en hielo, y homogenice con 20 movimientos. Luego, transfiera el homogenato a un tubo de centrífuga sobre hielo.

Centrifugar la muestra a 2000 G durante 10 minutos. A cuatro grados Celsius. Retire el sobrenadante, que contiene el material citoplasmático y los resus.

Suspenda el sedimento en dos mililitros de tampón de lavado C frío con inhibidores de proteasas, y depósito suavemente el material resuspendido sobre un cojín de sacarosa al 30 % de cinco mililitros en un tubo de centrífuga frío. Para aislar los núcleos, centrifugue a 2 400 ×g durante cinco minutos en un rotor de cubeta oscilante; los núcleos migrarán a través del cojín y los restos celulares permanecerán en la interfase. Tras la centrifugación, retire cuidadosamente todo el volumen líquido y resuspenda los núcleos en 250 microlitros de tampón de lavado C frío con inhibidores de proteasas; luego transfiera los núcleos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Para comenzar el aislamiento de nucleosomas, agregue tres microlitros de cloruro de calcio 0,1 molar a los núcleos y coloque en un bloque térmico a 37 grados Celsius hasta que se alcance el equilibrio térmico. Luego, añada dos unidades de micrococcal nuclease en 10 microlitros de tampón de micrococcal nuclease e incube durante 12 minutos a 37 grados Celsius. Mezcle frecuentemente con la punta de una pipeta.

Después de la incubación, detenga la reacción con seis microlitros de E-D-T-A de sodio 0,5 molar a pH 8 y coloque en hielo para enfriar. A continuación, centrifugue la muestra a 2000 ×g durante cuatro minutos; tras la centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspenda el precipitado en 300 microlitros de EDTA de sodio 0,2 milimolar. Incube la muestra en hielo durante una hora, mezclando ocasionalmente con pipeteo suave.

Tras una centrifugación a 3000 G durante cuatro minutos, a cuatro grados Celsius, recolecte el sobrenadante, que contiene los nucleosomas libres, en un nuevo tubo Fuge y almacénelo en hielo para un reuso deliberado de nucleosomas adicionales. Suspenda el precipitado en 300 microlitros de 0,2 milimoles de EDTA sódico como antes e incube en hielo durante una hora con mezclas suaves ocasionales.

Después de la incubación, centrifugue la muestra. Nuevamente, combine el sobrenadante resultante con la muestra restante en el tubo de microcentrífuga sobre hielo. Para comenzar el ensayo de nucleosomas por ELISA, cargue una placa ELISA de 96 pocillos con una serie descendente de cinco diluciones seriadas al doble de nucleosomas y tampón de recubrimiento, comenzando con 0,1 microgramos por 50 microlitros en el pocillo superior; todas las series de dilución deben cargarse por triplicado.

Recuerde incluir pocillos con solo tampón de recubrimiento como controles. Incube la placa durante la noche a cuatro grados Celsius al día siguiente. Utilice un lavador de placas para lavar las placas con 200 microlitros por pocillo de 0.5% entre 20 en PBS a temperatura ambiente, cuatro veces, para un total combinado de 10 minutos.

Ahora añada 100 microlitros por pocillo de solución bloqueante e incube durante una hora a temperatura ambiente en un rotador. Tras la incubación, elimine el tampón bloqueante agitando enérgicamente la placa invertida sobre un fregadero. A continuación, añada el anticuerpo primario diluido en un volumen de 50 microlitros por pocillo en una solución de 5 %PSA en 0,05 %between 20 en PBS e incube la solución durante una hora en un rotador a temperatura ambiente.

Después de la incubación con el anticuerpo primario, lave las placas como antes utilizando el lavador de placas. Una vez finalizado el procedimiento de lavado, agregue 50 microlitros por pocillo de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante diluido en PBS con 5%BS, A, y 0.5%20 e incube a temperatura ambiente durante una hora en un rotador tras la incubación con el anticuerpo secundario. Lave las placas como antes.

Uso del lavador de placas para desarrollar la placa. Añada 50 microlitros de sustrato TMB para ELIZA en cada pocillo e incube durante 10 minutos. A temperatura ambiente, los pocillos de la placa ELIZA se volverán azules y la intensidad será proporcional a la cantidad de modificaciones de nucleosomas presentes en cada uno.

A continuación, detenga la reacción. Añadiendo 50 microlitros por pocillo de ácido sulfúrico dos normal. El color cambiará a marrón; centrifugue la placa a 1500 RPM durante dos minutos para disipar cualquier burbuja de aire.

La placa ya está lista para la cuantificación en un lector de placas colorimétrico. Finalmente, lea la placa a 450 nanómetros y exporte los resultados para su análisis. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos días si se lleva a cabo correctamente después de su desarrollo.

Esta técnica abrió la puerta a los investigadores en el campo de la investigación de células madre para explorar las respuestas epigenéticas a eventos de diferenciación y reprogramación a nivel de todo el epiproteoma.