Caracterización de los aislados y ventilados, y pulmón de ratón instrumentado perfundidos con flujo pulsátil

Para estudiar las relaciones entre el flujo y la presión pulsatil en los pulmones. Este protocolo explica cómo aislar, ventilar y perfundir pulmones de ratón. La tráquea se expone quirúrgicamente para la ventilación.

Luego se aíslan el corazón y los pulmones para poder canular la arteria pulmonar y la aurícula izquierda. A continuación, se realiza la perfusión del sistema pulmonar. Los experimentos se llevan a cabo modificando el flujo, la magnitud, la forma de onda y/o la frecuencia de la arteria pulmonar.

Se registran las formas de onda de la presión de la arteria pulmonar y de la aurícula izquierda resultantes y demuestran las relaciones pulsátiles entre la presión y el flujo. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los preparados in vivo, es que se pueden obtener cambios en las relaciones entre presión y flujo. Las relaciones pulsátiles entre presión y flujo pueden obtenerse en ausencia de cambios en el estado de volumen, el tono del sistema nervioso simpático, la actividad y los efectos de la anestesia.

Además, la mayoría de los preparados pulmonares aislados miden únicamente relaciones estables de presión y flujo, mientras que nuestra técnica permite determinar relaciones pulsátiles de presión y flujo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología pulmonar, como cómo afecta la enfermedad vascular pulmonar a la hemodinámica pulmonar pulsátil, o cómo afecta el endurecimiento de la arteria pulmonar grande a la poscarga del ventrículo derecho. La demostración visual de este método es fundamental, ya que exponer el corazón y los pulmones y asegurar la cánula en la arteria pulmonar es difícil de aprender.

La presión excesiva proveniente de los instrumentos puede causar edema en los pulmones y una colocación inadecuada de la cánula puede perforar la arteria pulmonar. Antes de comenzar el experimento, es necesario preparar el sistema IL uno utilizado para ventilar y perfundir el pulmón aislado. Los tubos deben conectarse a los transductores de presión.

Lave completamente el sistema con agua destilada calentada a 37 grados Celsius utilizando la bomba y el medidor de flujo, y elimine todas las burbujas del tubo. A continuación, prepare el tubo de la bomba Endur tech con PBS al 1%. Ahora realice la puesta a cero.

La presión de cada transductor P 75 se ajusta primero cerrando su válvula hacia el sistema IL y abriendo su válvula hacia la atmósfera. Luego, utilice el amplificador de enchufe SIS para cero automático de la presión antes de preparar el animal. Humedezca el montaje IO humedeciendo la pieza porosa de cerámica en agua destilada. Después de anestesiar al ratón, estabilice al ratón para la cirugía fijando sus patas delanteras en un corcho.

Ahora rocíe el pecho con alcohol al 95%. Utilice pinzas rectas para sujetar la piel del cuello y haga una abertura de un centímetro con las tijeras rectas. Una vez expuesto el interior del cuello, corte el tejido glandular blanco en los músculos superficiales mientras busca el esófago y la tráquea.

Aislar el esófago y la tráquea del tejido de ambos lados y posteriormente, y colocar una sutura suelta alrededor de la tráquea. Para canular la tráquea, cortar cuidadosamente una pequeña incisión en forma de V en uno de sus lados con las tijeras pequeñas. Llevar ahora el ratón al sistema IL uno utilizando fórceps romos.

Sujete la cánula traqueal y deslícela dentro de la tráquea. Fije la cánula con una sutura. Comience la ventilación primero con aire ambiente, rocíe el tórax con alcohol y retire la piel utilizando fórceps rectos y tijeras rectas.

Corte la piel hacia arriba a lo largo del esternón. Levante la piel en cada lado y corte a lo largo de la línea de las costillas inferiores. Ahora sujete el proceso xifoides con pinzas y use tijeras de punta redondeada para hacer un orificio en el diafragma donde se une con la parte inferior del esternón.

Agarre el diafragma y córtelo separándolo de las costillas. Con tijeras de punta redonda, sujete nuevamente el apéndice xifoides y utilice las tijeras para cortar cuidadosamente hacia arriba por el esternón a través de las costillas sin dañar los pulmones, el corazón ni los vasos sanguíneos. Para exponer el corazón, agarre las costillas izquierdas y corte sus puntas.

Ahora inyecte lentamente 0,1 mililitros de heparina en el ventrículo derecho. Después de la inyección, corte el resto de las costillas. Utilice la parte trasera o el extremo redondeado de la pinza para empujar suavemente los pulmones lejos de la costilla mientras corta las costillas bajo un microscopio. Retire el tejido glandular presente en la grasa situada encima del corazón.

Utilice la pinza para separar los tejidos y recórtelos. Con las tijeras de resorte, coloque una sutura alrededor de la aorta y la arteria pulmonar, y levante suavemente el corazón con una pinza roma. Debe haber poca resistencia.

Ahora, haga una sutura suelta con el doble nudo. A continuación, corte el abdomen inferior. Utilice tijeras anguladas para cortar a través de las costillas y la columna vertebral.

Esto provocará un flujo sanguíneo considerable. Utilice un hisopo para detener el flujo. Una vez que se detenga el flujo sanguíneo, prepare el sistema IL con cuatro mililitros de RPMI provenientes de una jeringa cargada con 10 mililitros de RPMI.

Es recomendable verificar dos veces que el tubo no contenga burbujas. Ahora canule el ventrículo derecho realizando una pequeña muesca cerca del ápice e insertando la cánula. Apunte hacia abajo y hacia la derecha para alcanzar la arteria pulmonar. La punta de la sonda debe ser visible a través de la pared casi transparente de la arteria pulmonar.

Luego, apriete la sutura alrededor de la cánula, la aorta y la arteria pulmonar para canular el ventrículo izquierdo. Haga una muesca en el ápice e inserte la cánula orientada hacia arriba en la aurícula izquierda. Puede ser necesario aplicar una ligera presión para localizar la válvula, pero una vez encontrada, la cánula se deslizará a través de ella y quedará fija sin necesidad de sutura.

Infunda manualmente RPMI desde la jeringa de 10 mililitros a 0,3 mililitros por minuto hasta que observe flujo en el tubo de salida. Si no hay flujo en el tubo de salida, reposicione la cánula del ventrículo izquierdo. Sin embargo, si no hay flujo en los pulmones, interrumpa el experimento porque probablemente la arteria pulmonar tenga una fuga.

Ahora que el corazón está completamente canulado, conecte la jeringa de 60 mililitros al sistema IL uno. Utilice la bomba de flujo constante para infundir el RPMI Perfuse ocho a una velocidad de un mililitro por minuto. Verifique fugas durante la perfusión inicial.

Perfusione gradualmente los pulmones durante otros dos minutos, tiempo durante el cual los pulmones se volverán blancos. Para estudios de flujo pulsátil. Primero, ajuste el desplazamiento del pistón de la bomba única a los niveles deseados.

Luego, establezca el caudal constante. Ahora abra la válvula hacia la bomba osli e inicie la grabación de datos justo antes de ejecutar el perfil de flujo osli. Una vez finalizado, abra el archivo de salida de datos y represente gráficamente el flujo experimental basado en los flujos experimentales del ensayo inicial.

Ajuste el desplazamiento del pistón de la bomba oscilatoria en cada frecuencia para que Q máx sea el deseado. Mantenga la ventilación a una presión constante. Durante la recopilación de datos para los ensayos de flujo constante, cierre la válvula hacia la bomba individual y establezca el caudal constante al nivel deseado. Comience a registrar los datos y siga los pasos del protocolo de flujo constante.

Recopile datos durante al menos 10 segundos a cada caudal entre los ensayos. Restablezca el caudal a 0,5 mililitros por minuto. Asegúrese de mantener la ventilación a una presión constante durante la recopilación de datos.

Si se desean ensayos con presión auricular izquierda cero, retire el tubo de salida mientras realiza los ensayos. Observe atentamente la presencia de RPMI en el tubo de la vía aérea. No debe permitirse que el RPMI alcance los transductores de presión de la vía aérea, ya que podrían dañarse.

Aquí se muestran los resultados de la perfusión con flujo constante con flujo Q en la fila superior y las presiones resultantes en la arteria pulmonar y la aurícula izquierda en la segunda fila bajo diversas condiciones. En los dos primeros paneles, la presión en la aurícula izquierda aumentó y disminuyó con Q porque se colocó el tubo de salida; el primer panel muestra la presión del aire al final, presión inspiratoria, y el segundo muestra la presión del aire al final de la espiración. A continuación, se retiró el tubo para que la presión en la aurícula izquierda fuera constante e independiente de Q. Luego, se ajustó manualmente la altura del tubo de salida para que la presión en la aurícula izquierda fuera más alta.

Pero independientemente de Q nuevamente, el primer panel muestra la presión del aire al final, la presión inspiratoria, y el segundo muestra la presión del aire al final. Presión espiratoria. Las relaciones resultantes entre el flujo y la presión en la arteria pulmonar en estado estable para cada caso pueden obtenerse graficando la presión frente al flujo.

Aquí se muestran los resultados de la perfusión con flujo pulsátil con flujo Q en el panel superior y las presiones resultantes en la arteria pulmonar, la aurícula izquierda y las vías aéreas. En el panel inferior. A partir de estas relaciones entre presión y flujo pulsátiles en la circulación pulmonar, se puede calcular la impedancia vascular pulmonar, que refleja la poscarga total del ventrículo derecho.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 20 a 30 minutos. Al intentar este procedimiento, es importante tomarse el tiempo necesario y relajarse para mantener las manos firmes. Una vez que los pulmones estén adecuadamente perfundidos, la parte difícil habrá terminado.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas, como histología o ensayos bioquímicos en el tejido pulmonar, para responder preguntas adicionales, tales como qué mecanismos moleculares son responsables de los cambios observados en las relaciones pulsatiles de presión y flujo pulmonar. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la fisiología pulmonar exploren el papel de genes y proteínas específicos en el desarrollo y progresión de enfermedades vasculares pulmonares mediante el uso de ratones modificados genéticamente.