La cuantificación individual Microvessel Permeabilidad en aislado de rata Blood-perfundido Preparación de pulmón
30 de junio de 2014
La preparación aislada de pulmón perfundido con sangre hace que sea posible visualizar las redes de microvasos en la superficie del pulmón. A continuación se describe un método para cuantificar la permeabilidad de la microvasculatura individuales en pulmones aislados utilizando imágenes de fluorescencia en tiempo real.
El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la permeabilidad en microvasos individuales de pulmones de rata aislados utilizando un método basado en fluorescencia. Esto se logra primero aislando los pulmones de las ratas y perfundiéndolos con sangre autóloga. El segundo paso del procedimiento es insertar un microcatéter auricular izquierdo en una pequeña región del pulmón para infundir dextrina marcada con cuatro floras.
Luego, mientras se infunde la dextrina marcada, se recogen imágenes de los microvasos pulmonares. El paso final es cuantificar la permeabilidad de los microvasos individuales a partir de las imágenes mediante un software. En última instancia, los resultados pueden mostrar el grado de permeabilidad de los microvasos pulmonares en diferentes condiciones, como después del tratamiento con LPS.
La demostración de este procedimiento estará a cargo del Dr. Kava Kasami, un becario postdoctoral de mi laboratorio Begin, realizando una traqueotomía en una rata macho en un plano quirúrgico confirmado de anestesia. Utilice una cánula traqueal de PE 90 y asegúrela con suturas. A continuación, infunda el corazón de 100 a 200 unidades de heparina con una aguja de mariposa de calibre 21.
Espere un minuto y luego exanguine la sangre. Recoge la sangre y déjala a un lado con solución salina. Llene dos cánulas hechas de tubo de tigón de tres milímetros de cuatro centímetros de largo y ensanchadas en un extremo.
Ahora realice una toracotomía. Haga una incisión lo suficientemente grande para que la cánula penetre en el ventrículo derecho y deslícela en la abrazadera ensanchada de una cánula hacia la arteria pulmonar. Asegure la cánula con suturas.
Use la misma técnica para insertar la otra cánula en el ápice del ventrículo izquierdo hacia la aurícula izquierda. Asegúralo con cinta umbilical de dos milímetros de ancho. Ahora retire los tejidos conectivos que lo impiden y retire el largo y el corazón junto con las cánulas.
Transfiéralos a una placa de Petri con la superficie diafragmática del pulmón hacia arriba y las tres cánulas alineadas. Mueva la preparación diseccionada a una etapa ajustable equipada con un tubo de tigón número 18 conectado a transductores de presión que sirven como tubos de entrada y salida. Ahora mezcle la recolección de sangre con un volumen igual de solución de albúmina al 5%.
Agregue esta mezcla al depósito de carga. Encienda la bomba a 14 mililitros por minuto. Asegúrese de que el tubo no tenga burbujas de aire.
En la preparación. Conecte la arteria pulmonar al tubo de entrada del pulmón y la cánula auricular izquierda al tubo de salida. Verifique que no haya aire en el tubo y también verifique que la derivación esté abierta.
Conecte la cánula traqueal a un tercer transductor de presión. Inflar los pulmones a través de la cánula traqueal con un 30% de oxígeno. Mantenga los pulmones a cinco centímetros de presión de agua.
Ahora sujete la derivación y encienda la bomba a 14 mililitros por minuto. Para iniciar la perfusión pulmonar durante la perfusión, ajuste la bomba para mantener la presión pulmonar a unos 10 centímetros de agua y mantener la presión de la aurícula izquierda a tres centímetros de agua. Comience con la preparación del pulmón infundido con sangre.
Primero, construya un catéter de infusión a partir de un tubo de PE 10 de 40 centímetros de longitud insertado en un tubo de PE 90 de 30 centímetros de longitud. Conecte el otro extremo del tubo de PE 10 a una aguja de calibre 30 conectada a una jeringa de un cc. Lleve el extremo del tubo conectado al pulmón por encima de la preparación y conecte el catéter de infusión a él.
Guíe el catéter de infusión a la aurícula izquierda y luego al pulmón hasta que encuentre resistencia. Una fuerza excesiva dañará el pulmón. La incisión adecuada del microcatéter es fundamental, ya que cualquier daño al pulmón por el microcatéter reducirá el éxito del protocolo.
A continuación, llene la jeringa con timbres y conéctela a una bomba. Infundir lentamente la solución a una velocidad de 10 microlitros por minuto. Gradualmente, el sitio de infusión se volverá pálido en comparación con el resto del pulmón para mantener la superficie pulmonar húmeda rápidamente en plástico, con la excepción del sitio de infusión.
Ahora, para visualizar el pulmón, cree una ventana de visualización colocando una junta tórica en un cubreobjetos de 22 milímetros. Con grasa para llaves de paso, asegure la junta tórica a un soporte para tubos de ensayo. A continuación, coloque la ventana sobre el lugar de infusión.
Completa la configuración balanceando un objetivo de 20 aumentos sobre el cubreobjetos y enfocándote en el pulmón. No se espera distorsión visual. Ahora infunda el pulmón con una solución de su elección.
En este ejemplo, después de la solución salina, se infunde un mililitro de dextrina conjugada ZI en el pulmón a través de la bomba de jeringa en el transcurso de 60 minutos. Con el uso del software de diagnóstico por imágenes, registre una imagen por minuto durante la infusión de una hora y continúe grabando durante el lavado posterior. Paso durante 10 minutos más. Después de infundir la dextrina Fitz, lávela infundiendo la solución pulmonar del timbre durante al menos otros 10 minutos al mismo flujo. Más tarde. Al analizar las imágenes adquiridas, marque la intensidad máxima de fluorescencia en la región de interés durante la infusión de ajuste.
A continuación, marque la intensidad máxima de fluorescencia de la fluorescencia residual después del lavado de 10 minutos. Los cambios en la permeabilidad vascular se investigaron utilizando la infusión de dextrina fitzy después del tratamiento con lipopolisacárido bacteriano, ya que este es un modelo ampliamente utilizado de un LI. La fluorescencia residual de ajuste e fue baja en los microvasos tratados con ringers, pero alta en los tratados con LPS. Además, en comparación con la infusión de timbre, la infusión de LPS causó una reducción significativa en el índice de permeabilidad, lo que sugiere un aumento global de la permeabilidad en todos los vasos dentro del campo de imagen.
Además, en comparación con la infusión de timbre, la infusión de LPS causó una reducción significativa en el índice de permeabilidad, lo que sugiere un aumento global de la permeabilidad en todos los vasos dentro del campo de imagen. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar pulmones profilácticos de aves aisladas, insertar un microcatéter de cola izquierda y definir la permeabilidad en micro.
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Descripción general
Este artículo describe un método para cuantificar la permeabilidad de microvasos individuales en pulmones aislados de rata mediante imágenes de fluorescencia en tiempo real. La preparación del pulmón perfundido con sangre aislado permite la visualización de redes de microvasos en la superficie pulmonar.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología vascular
- Imagen de fluorescencia
Antecedentes
- Comprender la permeabilidad de los microvasos es fundamental para estudiar la función pulmonar.
- Los preparados pulmonares aislados proporcionan un entorno controlado para experimentación.
- La imagen por fluorescencia permite la observación en tiempo real de la dinámica de los microvasos.
- Estudios previos han demostrado el impacto de diversos tratamientos sobre la permeabilidad vascular.
Objetivo del estudio
- Cuantificar la permeabilidad en microvasos individuales de pulmones de rata aislados.
- Utilizar un método basado en fluorescencia para mediciones precisas.
- Evaluar los efectos de condiciones como el tratamiento con LPS sobre la permeabilidad de los microvasos.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de pulmones de rata y perfusión con sangre autóloga.
- Inserción de un microcatéter en la aurícula izquierda dentro del pulmón.
- Infusión de dextrina marcada con fluoresceína en los microvasos.
- Recolección de imágenes durante el proceso de infusión para su análisis.
Resultados principales
- Se logró la cuantificación de la permeabilidad en microvasos individuales.
- Los resultados indicaron grados variables de permeabilidad bajo diferentes condiciones experimentales.
- La imagen de fluorescencia proporcionó una visualización clara de las redes de microvasos.
- Los datos respaldan una mayor investigación sobre los efectos de los tratamientos en los microvasos pulmonares.
Conclusiones
- El método cuantifica eficazmente la permeabilidad de microvasos en pulmones aislados.
- La imagen en tiempo real es una herramienta valiosa para la investigación vascular.
- Los hallazgos contribuyen a comprender las respuestas vasculares pulmonares frente a diversos estímulos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la cuantificación directa de los cambios en la permeabilidad en microvasos pulmonares individuales bajo condiciones inflamatorias, proporcionando una comprensión mecanicista de las vías de fuga vascular. Al combinar la perfusión pulmonar aislada con imágenes de fluorescencia en tiempo real, apoya la validación de dianas en modelos de inflamación pulmonar y facilita la evaluación preclínica de candidatos protectores de la barrera. Este enfoque reduce la dependencia del procesamiento de tejidos en puntos finales, acelerando la adquisición de datos para decisiones de avance o interrupción en las fases iniciales del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Mide en tiempo real la fuga de líquido a través de segmentos venulares y capilares para investigar hipótesis terapéuticas en la inflamación vascular.
- Valor operativo: Permite la comparación paralela de las respuestas de permeabilidad entre lechos vasculares dentro de la misma preparación pulmonar.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas de intensidad de fluorescencia para evaluar los efectos del compuesto sobre la permeabilidad de microvasos.
- Valor operativo: Estandariza las condiciones de perfusión e imagen para cribado vascular reproducible y de alto contenido.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Relaciona los cambios de permeabilidad inducidos por LPS con mecanismos relevantes para la enfermedad en lesión pulmonar aguda.
- Valor operativo: Apoya la modelización de respuesta a la dosis y la correlación farmacocinética-farmacodinámica en estudios preclínicos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta las pruebas de eficacia preclínica, particularmente para moduladores vasculares pulmonares.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas mediante la cuantificación de la función de barrera vascular en respuesta a estímulos inflamatorios.
- Tamizaje: Proporciona salidas cuantificables y listas para ensayos para evaluar los efectos de compuestos sobre la permeabilidad de un solo vaso.
- Análisis: Ofrece cálculos del índice de permeabilidad a partir de imágenes de lapso de tiempo para permitir el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta las respuestas microvasculares con modelos preclínicos de lesión pulmonar mediante desafío con LPS.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar la permeabilidad vascular en múltiples clases de compuestos y modelos de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en las vías de fuga vascular mediante una resolución directa a nivel de un solo vaso.
- Valor operativo: Estandariza los protocolos de infusión con microcatéter y de obtención de imágenes para lograr reproducibilidad entre laboratorios.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar señales cuantitativas tempranas de seguridad vascular.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos basada en sus efectos sobre el sistema vascular pulmonar.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía de roedores, canulación vascular y microscopía de fluorescencia.
- Depende de sistemas de perfusión regulados por presión e infraestructura para imágenes intravital.
- Necesita la estandarización de tasas de infusión, concentraciones de fluoróforos y protocolos de lavado entre diferentes equipos.
- La adaptación a otras especies o modelos de enfermedad puede requerir la validación de parámetros de perfusión y accesibilidad vascular.
- Las limitaciones prácticas incluyen la complejidad técnica del posicionamiento de microcatéteres y el posible trauma pulmonar derivado de la canulación.
