PGS elastomérico andamios en ingeniería de tejidos arteriales

Este video muestra cómo fabricar andamios tubulares porosos y someterlos a un acondicionamiento mecánico dinámico para la ingeniería de tejidos arteriales. Esto se logra primero fabricando los andamios mediante un elastómero biodegradable y el método de fusión por aspersión. Luego, los andamios se preparan para la siembra celular y se ensamblan en un sistema de biorreactor.

En el biorreactor, las células musculares lisas vasculares siembran los andamios y se cultivan. Semanas después, se recoge el tejido y se analiza mediante microscopía electrónica de barrido, tinción con hematoxilina y eosina y autofluorescencia de elastina. El músculo liso resultante es tanto multicapa como de orientación perpendicular.

La principal ventaja de esta técnica en comparación con métodos existentes como el blanqueo de partículas consiste en utilizar un molde de vidrio para fabricar una estructura tubular porosa con ácido hialurónico. A medida que el molde se elimina, el andamiaje se prepara a partir de un trozo de tubo de vidrio. Coloque el tubo en un soporte y vierta en el interior la solución de ácido hialurónico preparada el día anterior.

El ácido hialurónico fluye lentamente hacia abajo a lo largo de la pared interna. Cuando llegue al fondo del molde, invierta el molde. Repita este paso hasta que la pared interna del molde esté uniformemente recubierta por la solución.

Después del recubrimiento, seque todos los moldes de vidrio preparados en una estufa al vacío a 37 grados Celsius durante 24 horas. Normalmente, se preparan cuatro moldes simultáneamente mientras los moldes de vidrio se secan. Prepare las vertidas de partículas de sal, muela y tamice las partículas de sal SVE a entre 25 y 32 micrómetros.

Al día siguiente, ensamble el mandril de molde de vidrio preparado, el tubo de PTFE, la funda termorretráctil y el anillo de PTFE. Primero, coloque el mandril en segmentos de 65 milímetros de longitud de tubo de PTFE y colóquelos a horno durante cinco minutos a 120 grados Celsius. Mientras espera, para encoger el PTFE, precaliente un incubador de hibridación a 37 grados Celsius durante al menos 30 minutos.

Una vez que el tubo haya cubierto los mandriles, deslice el manguito termorretráctil sobre el mandril para que se mueva libremente. Luego coloque el mandril dentro del molde de vidrio y sujete el anillo de A-P-T-F-E en la parte inferior del mandril. Verifique que el anillo de PTFE quede firmemente ajustado en la parte inferior del molde de vidrio.

A continuación, utilizando una espátula y un embudo de caucho de silicona, agregue papillas de partículas de sal al molde de vidrio. Luego, golpee suavemente el molde con la espátula para lograr una distribución uniforme de las partículas y retire el exceso de sal. Ahora apague el incubador calentado y coloque rápidamente los moldes rellenos de sal; la sal se fusionará durante los próximos 30 minutos, tras lo cual seque los moldes en un horno al vacío a 37 grados Celsius durante 24 horas.

Al día siguiente después del enfriamiento, retire el mandril de acero inoxidable de los moldes empujándolo hacia afuera mientras sujeta el anillo de PTFE. Si es necesario, utilice pinzas de punta fina. Luego, retire el anillo de PTFE de la parte inferior del molde.

A continuación, hornee los moldes para encoger la funda y retire las fundas encogidas de los moldes. Deje enfriar los moldes hasta que se utilicen y guárdelos en un desecador dentro de una campana. Utilizando un gotero, coloque los moldes de vidrio en un ángulo de 45 grados e introduzca gotas de solución de PGS en su luz interna mientras gira lentamente el molde.

Verifique si la solución de PGS fluye hacia abajo por la pared del molde. Si hay un punto seco, agregue más PGS. Ahora permita que el THF se evapore en la campana durante al menos 30 minutos. Una vez que el THF haya desaparecido, cure los moldes en un horno al vacío.

Después de curar durante un día, enfríe los moldes a temperatura ambiente y sumérjalos lentamente, en forma vertical, en agua desionizada a 24 grados Celsius. Inclinarlos demasiado rápido crea burbujas de aire, que rompen el andamio. Transfiera cuidadosamente los moldes al baño de agua.

Colóquelos en un ángulo utilizando un tubo de silicona y deje que el ácido hialurónico se disuelva durante una hora. Si después de una hora el ácido hialurónico no se ha liberado del molde, con el molde aún sumergido, utilice una espátula para empujar lentamente el ácido hialurónico desde ambos extremos y luego agite suavemente el molde. Ahora, verifique que los andamios no se hayan movido dentro del molde de vidrio, y en caso afirmativo, tire lentamente del andamio con pinzas para liberarlo del molde.

A continuación, elimine las partículas de sal lixiviándolas al transferir cuidadosamente los andamios delicados a un baño de agua desionizada con agitación suave. Este proceso tomará al menos tres días y requiere que el agua se cambie diariamente. Una vez que toda la sal haya sido eliminada, transfiera cada andamio a un tubo cónico de 15 mililitros lleno con agua desionizada y congélelos en una caja de hielo seco durante una hora. Coloque los tubos cónicos congelados en un liofilizador durante tres días con las tapas abiertas.

Una vez liofilizados, almacene los andamios en un desecador hasta su uso. Comience cortando los andamios en longitudes de 25 a 30 milímetros. A continuación, prepare dos tapones de caucho de silicona pasando un tubo de PTFE a través de los orificios centrales de cada tapón.

Luego, corte longitudes de un milímetro y medio del anillo HS y deslice un tramo sobre un extremo del andamio. Introduzca un tubo de PTFE unido al tapón en el mismo extremo del andamio, con suficiente superposición como para quedar debajo del anillo HS, asegurando así la conexión firme del andamio al tubo. Encojer el anillo HS en un horno y deje que el conjunto se enfríe hasta la temperatura ambiente. Ahora, un tubo de policarbonato de 50 milímetros, que funciona como la cámara del biorreactor, se desliza sobre el andamio y se fija en la superficie interna del tapón de caucho de silicona.

Al igual que antes, se fija otro tubo de PTFE y un tapón en el otro extremo del andamio con un anillo hs para completar la cámara. El segundo tapón se une al otro extremo del tubo de policarbonato. A continuación, las superficies externas de los tapones se fijan a dos placas de aleación de aluminio.

Introduzca dos varillas roscadas en el orificio lateral de cada placa y asegure las placas con tornillos de mariposa. Sujete el andamio al biorreactor. Ahora mida la longitud visible de cada andamio, que es la distancia entre los dos anillos hs, y calcule sus áreas superficiales internas.

Para la siembra celular. En un autoclave, esterilice las cámaras envueltas individualmente en papel de aluminio junto con cada parte de la unidad del biorreactor. Una vez esterilizadas, arme el biorreactor dentro de una cabina de cultivo celular.

Pretratamiento y enjuague del andamio con una serie de perfusiones utilizando una bomba peristáltica a un milímetro por minuto en el circuito de flujo. Comience enjuagando con etanol al 70 %, etanol al 50 % y luego etanol al 25 % durante una hora cada uno. Después de los tres enjuagues con etanol, realice un enjuague con PBS durante dos horas.

Finalmente, perfundir el biorreactor con medio de cultivo para células musculares lisas durante 24 horas, tras lo cual quedará listo para la siembra celular y los experimentos. A continuación, siguiendo las instrucciones del manuscrito adjunto, sembrar el biorreactor con 2 millones de células por centímetro cuadrado y, durante los siguientes 21 días, cambiar el medio del tubo y realizar ajustes en la velocidad de la bomba. Gradualmente, la presión en el constructo aumentará de aproximadamente cuatro milímetros de mercurio el primer día de cultivo a más de 100 milímetros de mercurio después de dos semanas en cultivo; tras tres semanas en cultivo, cosechar las células y prepararlas para su análisis según se especifica en el manuscrito adjunto.

Estos andamios tubulares de PGS fueron fabricados mediante el método de fusión con sal. Micrografías electrónicas de barrido demostraron que todos los andamios presentaban espesores de pared homogéneos y no se observaron defectos parciales en sus secciones transversales. Se observaron poros macro y micro distribuidos aleatoriamente en la superficie luminal de todos los andamios.

Después del cultivo celular, las células musculares lisas multilaminares crecieron con una orientación perpendicular a la dirección del flujo. Además, las células y las proteínas de la matriz descelularizada cubrieron completamente la luz de todos los constructos de PGS. La autofluorescencia de la elastina también mostró fibras elásticas organizadas circunferencialmente en la superficie luminal del constructo.

Después de ver este video, debería comprender cómo fabricar un andamio tubular poroso, observar las células y cultivar el andamio utilizando un biorreactor de diseño previo.