Dominio transmembrana Oligomerización propensión determinada por el ensayo toxR

El objetivo general del siguiente experimento es investigar las tendencias de ligamentización de proteínas, dominios transmembrana o dominios TM, en un entorno de membrana natural. Esto se logra expresando el dominio transmembrana de interés en Escherichia coli como una proteína quimérica con la proteína de unión a maltosa para su localización en el periplasma y ToxR como reportero transcripcional. La ligamentización inducida por el dominio transmembrana provoca la dimerización de ToxR y la activación de la transcripción de LXi. Como segundo paso, las células se lisan y se tratan con ONPG, que es hidrolizado por β-galactosidasa a la especie absorbente de luz O-nitrofenolato u ONP.

A continuación, los niveles de ONP se cuantifican midiendo la absorbancia de luz a 405 nanómetros. Con el fin de determinar los niveles del dominio transmembranal, los resultados de ligamentización revelan la propensión a la ligamentización de los dominios transmembranales basándose en un ensayo con el sistema reportero tox R. La ventaja principal de esta técnica frente a los métodos biofísicos existentes, como la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS o la fluorescencia, es que el comportamiento del dominio transmembranal se estudia en una bicapa de fosfolípidos natural mediante su expresión en E. coli, en lugar de en un sistema que imita la membrana, como un detergente.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las proteínas de membrana, como la elucidación de características estructurales importantes implicadas en la asociación de hélices transmembrana. Antes del inicio de este protocolo, se preparan siete plásmidos que expresan la proteína quimérica requerida a partir de oligonucleótidos sintetizados comercialmente, representando la TDS de interés flanqueada por NHE uno y BMH uno. Sitios de restricción después de que los plásmidos hayan sido preparados, descongele suavemente las células competentes fhk 12 en hielo. Una vez descongeladas, transfiera las células a tubos de cultivo de 15 mililitros y añada 200 nanogramos de cada ADN plasmídico a un tubo separado e incube las células en hielo durante 30 minutos.

Luego, someta las células a un choque térmico durante 90 segundos a 42 grados Celsius, seguido de una incubación en hielo durante dos minutos con 800 microlitros de medio SOC e incube las muestras a 37 grados Celsius con agitación durante una hora; después de la incubación, inocule cinco mililitros de medio LB que contenga cloranfenicol y aose con 50 microlitros de la mezcla de transformación utilizando tubos de cultivo de 15 mililitros por triplicado para cada muestra. Finalmente, incube las muestras a 37 grados Celsius con agitación durante 20 horas. Para medir la totalidad de la ligamentización, se determina la actividad de la beta-galactosidasa TDS.

Primero, precaliente el lector de placas a 28 grados Celsius. Utilice el stock de tampón Z para preparar soluciones frescas de tampón Z según se describe en el protocolo escrito. Transfiera el cloroformo de tampón Z desde el tubo al depósito, asegurándose de pipetear únicamente la capa acuosa superior del cloroformo de tampón Z.

Coloque la placa de 96 pocillos sobre un papel con una cuadrícula dibujada para asegurar una transferencia precisa con la pipeta: añada 100 microlitros de buffer Z con cloroformo a cada pocillo de una placa de 96 pocillos, seguido de cinco microlitros de cada cultivo en cuadruplicado. Omita el cultivo en los cuatro pocillos que servirán como blancos. Mida la DO a 595 nm de la placa para determinar la densidad celular.

Añada 50 microlitros de tampón Z SDS a todos los pocillos de la placa. Luego agite la placa en el lector de placas durante 10 minutos para lisar las células tras la lisis celular con 50 microlitros de ZPA para ONPG en todos los pocillos. Devuelva la placa al lector de placas y mida la DO a 405 cada 30 segundos durante 20 minutos.

Determine el nivel de actividad de beta lactasa mediante el cálculo de unidades de Miller normalizadas respecto al blanco. Se realiza un inmunotransferencia (Western blotting) para verificar la expresión proteica equivalente entre los constructos. Primero, combine 50 microlitros de los cultivos por triplicado y luego centrifugue las muestras utilizando una microcentrífuga.

Retire el sobrenadante mediante pipeteo y resuspenda. Suspenda el pellet residual en dos volúmenes de tampón de carga de muestra, cargue 7,5 microlitros de cada muestra en un gel estándar al 8 % y realice la electroforesis a 125 voltios durante una hora y cinco minutos después de la transferencia. Incube la membrana con el anticuerpo conjugado anti M-V-P-H-R-P para visualizar la proteína quimérica, que se observa aproximadamente a 70 kilodalton, con algunos productos de degradación que a veces se ven alrededor de 48 kilodalton.

Se observa también MVP endógena a 45 kilodalton. Con el fin de evaluar la inserción adecuada en la membrana del constructo quimérico de TMD, se utiliza la línea celular PD 28 deficiente en proteína de unión a maltosa, ya que cuando se cultivan en medio mínimo con maltosa como única fuente de carbono, solo pueden crecer aquellas células que expresan un producto de expresión integral en la membrana con la proteína de unión a maltosa correctamente localizada en el periplasma. Transforme las células PD 28 como se describió para las células fhk 12 e inocule dos mililitros de medio LB.

Cultive las células a 37 grados Celsius con agitación a 300 RPM durante la noche después de la incubación. Pelote las células por centrifugación y lávelas mediante resuspensión en dos mililitros de PBS y pipeteo suave con una punta grande. Después de pelotar, lave nuevamente las células con PBS por segunda vez, luego realice una centrifugación final y resuspensión en un mililitro de PBS.

Utilice 25 microlitros de las células resuspendidas para inocular cinco mililitros de medio mínimo. Incube las células a 37 grados Celsius con agitación durante 15 horas. Transfiera 200 microlitros de cada muestra a una placa de 96 pocillos y tome la lectura de OD 5 9 5 utilizando el lector de placas.

Repita este proceso cada dos horas hasta las 25 horas. Se analizó la propensión total a la ligamentización de dominios transmembrana individuales del dominio integral de membrana multispanning, la proteína de membrana latente uno, utilizando el ensayo del reportero transcripcional tox R. El dominio transmembrana cinco exhibe una fuerte propensión a ligamentizarse, como lo demuestran las altas unidades Miller, lo cual es comparable con el control positivo GPA, una secuencia dimerizante bien establecida.

Una mutación perjudicial en el dominio transmembrana cinco D uno 50 A reduce la capacidad de la secuencia para ligar completamente LMP uno, TM uno no ligar completamente de manera significativa y exhibe una señal muy baja en unidades Miller, apenas por encima de la señal del blanco, que corresponde a células FHK 12 no transformadas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar si un helice transmembrana de interés tiene la capacidad de formar complejos de orden superior en un entorno natural de membrana. Al realizar este procedimiento, es importante pipetear extremadamente con cuidado en la placa de 96 pocillos para evitar errores grandes y asegurarse de que no se introduzcan burbujas de aire.