Tridimensional óptico resolución microscopía fotoacústica

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la microscopía fotoacústica con resolución óptica in vivo, u OR-PAM, de la microcirculación, que es no invasiva y no requiere marcado. Esto se logra primero anestesiando al animal experimental. El segundo paso del procedimiento consiste en posicionar la región de interés trasladando la cabeza de imagen del microscopio de resolución óptica; luego se establecen los parámetros de escaneo y se inicia la adquisición de imágenes.

Finalmente, las distribuciones de la concentración total de oxígeno y de la saturación de oxígeno de la hemoglobina se obtienen mediante el cálculo de los datos experimentales de múltiples longitudes de onda. La microscopía fotoacústica con resolución óptica se basa en la excitación láser y la detección ultrasónica. Un breve haz láser posterior se enfoca en el tejido biológico.

La absorción de luz genera un calentamiento transitorio y una emisión ultrasónica subsiguiente, que se recibe para formar una imagen. La ventaja única de, o Pam, es su detección libre de fondo y su exquisita sensibilidad a la absorción óptica. En contraste, las tecnologías microscópicas de reflexión óptica existentes son principalmente sensibles al scattering óptico o a la fluorescencia, siendo capaces de proporcionar imágenes de alta resolución sin etiquetado in vivo de la absorción óptica. RPM ha encontrado amplias aplicaciones biomédicas en neurología, oftalmología, biología vascular y dermatología.

La microscopía fotoacústica de resolución óptica, o pamm, consta de componentes ópticos y ultrasónicos. La fuente de irradiación óptica es un láser de colorante bombeado por un láser de pulso de estado sólido. El haz láser de salida se atenúa mediante un filtro de densidad neutra y se acopla a una fibra óptica de modo único para la entrega de luz, lo que permite el escaneo mecánico de la cabeza de imagen del microscopio en lugar del objeto vivo, con el fin de acoplar eficazmente el haz láser multimodo a una fibra óptica de modo único.

Primero se filtra mediante un orificio de 50 micrómetros de diámetro. El orificio está posicionado ligeramente alejado del foco de la lente condensadora para hacer coincidir su diámetro con el diámetro del haz en modo fundamental. Para crear un foco óptico casi limitado por difracción, la salida de la fibra de un solo modo se colima y llena la abertura trasera del objetivo del microscopio.

La detección ultrasónica implica un combinador acústico-óptico casero conectado a un transductor ultrasónico. El combinador alinea la irradiación óptica y la detección acústica coaxialmente. Se ha tallado una cavidad esférica en la parte inferior del combinador para producir una lente acústica con una apertura numérica de 0,5 en agua, lo que proporciona un diámetro focal acústico de 43 micrómetros a la frecuencia central de 50 megahercios.

Para el primer alineamiento, resulta útil utilizar ultrasonido de eco de pulso para determinar la posición del plano focal acústico. La cabeza de imagen se ajusta verticalmente hasta que se observa la señal ultrasónica máxima de eco de pulso. Para maximizar la sensibilidad de detección, se alinean los focos óptico y acústico. Confocal.

Se coloca un objetivo absorbente ópticamente, como un trozo de cinta aislante negra, en el plano focal acústico. Luego, se ajusta la posición focal óptica para maximizar la señal fotoacústica. El sistema PAM también incluye amplificadores electrónicos y convertidor analógico-digital, un escáner mecánico y un controlador de escáner.

La señal digitalizada se transfiere a una computadora para la formación de imágenes. El software convierte los datos brutos en una secuencia de imágenes bcan transversales. A medida que la cabeza del microscopio escanea por barrido el objeto, las imágenes registradas pueden mostrarse entonces como imágenes transversales individuales, imágenes de proyección de amplitud máxima en 2D o representaciones en 3D.

Un tanque de agua se utiliza para alojar la cabeza de imagen del microscopio. Se realiza una ventana de imagen en una placa de Petri y se sella con una membrana de polietileno transparente al ultrasonido y a la óptica. La onda fotoacústica generada por el objeto se acopla acústicamente al detector ultrasónico primero mediante gel ultrasónico entre el objeto y la membrana de polietileno, y luego mediante agua desionizada en la placa de Petri.

Estas invenciones y aplicaciones de láseres ópticos disponibles y del transductor de ultrasonidos constituyen el sistema PAM. En el siguiente segmento, obtendremos imágenes de la microvasculatura de un ratón vivo mediante este sistema. Si el animal que se va a imaginar no es un ratón desnudo, 24 horas antes del experimento es ideal realizar la depilación.

De este modo, se recupera la irritación de la vasculatura cutánea. Anestesie al ratón con vapor de isoflurano al 3 % en oxígeno de grado médico. El flujo típico oscila entre uno y 1,5 litros por minuto.

Dependiendo del peso corporal del animal. Mantenga la anestesia con 1 % de ISO fluorado durante todo el experimento; realice una compresión en el dedo del pie para asegurar que el ratón esté completamente anestesiado. Transfiera al ratón a una plataforma estereotáxica con una almohadilla calefactora para mantener su temperatura corporal a 37 grados Celsius.

Ahora aplane la oreja sobre la placa de plástico. A continuación, aplique una capa de gel de ultrasonido sobre la oreja. Evite atrapar burbujas de aire dentro del gel.

Aplicar también pomada oftálmica en los ojos para prevenir el secado o daños accidentales por el láser. Evite tocar directamente el ojo con el aplicador. Luego, coloque la oreja bajo la ventana de imagen y eleve lentamente la plataforma del animal hasta que el gel de ultrasonido entre en contacto con la parte inferior de la membrana.

Se requiere un contacto suave porque presionar el oído contra la membrana puede afectar el flujo sanguíneo en el oído. A continuación, tome algunas precauciones con el animal para monitorear su estado fisiológico. Coloque un oxímetro de pulso en la pata o la cola del ratón.

Ahora baje la cabeza de imagen hasta que la lente acústica esté sumergida en agua desionizada y elimine las burbujas atrapadas bajo la lente acústica. Configure el láser en modo de disparo externo e inicie el escaneo de prueba. Ajuste la posición Z de la cabeza de imagen hasta que los focos dual óptico y acústico se sitúen en el centro del oído.

Ahora configure los parámetros de escaneo e inicie la adquisición formal de imágenes. Para medir la concentración total de hemoglobina, ajuste la longitud de onda a un punto ISO espástico en el que la oxihemoglobina y la desoxihemoglobina tengan coeficientes molares de extinción iguales.

Para medir la saturación de oxígeno en la hemoglobina, ajuste la segunda longitud de onda al punto donde los coeficientes de extinción molar de la oxihemoglobina y la desoxihemoglobina presenten una diferencia notable. Una vez finalizado, limpie la oreja del ratón y coloque al ratón en una incubadora. Con la temperatura ambiental ajustada a 37 grados Celsius, cuando despierte, devuelva al ratón de forma natural a las instalaciones para animales.

Esta imagen de proyección de amplitud máxima muestra la anatomía vascular de la oreja de un ratón desnudo vivo, obtenida mediante or Pam a 570 nanómetros. Esta imagen de proyección muestra la saturación de oxígeno de la hemoglobina en la misma oreja. Se calcula a partir de las imágenes adquiridas a una longitud de onda isoespástica de 570 nanómetros y una longitud de onda dominante de absorción de desoxihemoglobina de 561 nanómetros.

Un examen más detallado de la región marcada muestra la resolución de oramm. Se observa claramente un lecho capilar densamente empaquetado. En este video, demostramos el protocolo experimental típico para ORPM, incluyendo la configuración del sistema, la alineación del sistema, el procedimiento experimental in vivo y el esquema de imagen funcional.

Uno de los aspectos más importantes en el diseño y funcionamiento del instrumento es el alineado confocal óptico-acústico, que es crucial para la sensibilidad de imagen, la resolución óptica en microscopía fotoacústica en combinación con microscopía fotoacústica de resolución acústica de penetración profunda y tomografía computarizada fotoacústica, lo que promete imágenes funcionales y moleculares in vivo a múltiples escalas, desde uñas de órganos, células, tejidos y hasta órganos completos, que pueden visualizarse con el mismo contraste. El origen, como la escalabilidad de la imagen, posee el potencial de revolucionar la investigación en sistemas biológicos multiescala y su traslación, desde descubrimientos microscópicos en el laboratorio hasta la práctica clínica macroscópica.