Lensfree en el chip tomográfica Microscopía empleo de multi-ángulo de iluminación y píxeles de super-resolución
16 de agosto de 2012
Lensfree tomografía óptica es una técnica de microscopía tridimensional que ofrece una resolución espacial de <1 m × m <1 × menos de 3 micras x, y y z dimensiones, respectivamente, más una gran imagen-volumen de 15-100 mm 3, Que puede ser particularmente útil para la integración con laboratorio en un chip plataformas.
El objetivo general de este procedimiento es lograr una imagen tridimensional sin lentes y directamente en un chip de especímenes biológicos, abarcando un gran volumen de imagen. Esto se consigue primero colocando la muestra directamente sobre el chip del sensor y proporcionando una iluminación parcialmente coherente. El segundo paso consiste en desplazar lateralmente la fuente de luz a diferentes posiciones para realizar la grabación.
Imágenes holográficas del ejemplo con desplazamiento de subpíxeles. A continuación, se desplazaron los subpíxeles. Se registraron imágenes holográficas en múltiplos de iluminación para obtención de imágenes tomográficas.
El paso final es el procesamiento de datos, en el cual el conjunto de datos adquirido se reconstruye digitalmente para obtener finalmente imágenes tomográficas tridimensionales de la muestra. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía óptica convencional es que proporciona imágenes de alto rendimiento en una arquitectura compacta. Esto hace que nuestra plataforma sea particularmente útil para la integración con plataformas de chip tipo Lebanon.
En este informe, se describe la configuración básica de imagen para una implementación de banco de trabajo orientada a la tomografía de muestras estáticas. Se ajustó un monocromador con una lámpara de xenón para proporcionar una salida con un ancho espectral aproximado de uno a 10 nanómetros alrededor de una longitud de onda central de 450 a 650 nanómetros. Esta salida parcialmente coherente se acopla luego a una fibra óptica multimodo para entregar luz parcialmente coherente al sistema.
La fibra óptica está montada sobre una plataforma de rotación motorizada para cambiar el ángulo de iluminación. La plataforma motorizada con la fuente de luz se monta sobre una plataforma lineal bidimensional XY, que se utiliza para realizar desplazamientos en el plano de la fuente de luz a un ángulo determinado para la detección. Se utiliza una matriz de sensores A-C-M-O-S de cinco megapíxeles con un tamaño de píxel de 2,2 micrómetros.
El detector se utiliza para registrar imágenes holográficas de campo amplio de las muestras. Es fundamental que la matriz de sensores esté posicionada en el mismo plano axial que el eje de rotación de la fuente de luz para asegurarnos de verificar si el sensor recibe suficiente luz en ángulos grandes de iluminación. Aunque la tomografía óptica sin lentes puede imaginar una variedad de objetos como células y microorganismos, los principios básicos se demuestran aquí mediante la microscopía tridimensional de una muestra de erizo de mar utilizando un bisturí o una espátula.
Tome un pequeño trozo de agar del plato de Petri que contiene el cultivo de órganos selladores. Un trozo cúbico de varios milímetros en cada dimensión contendrá cientos de nematodos. Coloque el pequeño trozo de agar en un vial de polipropileno que contenga un mililitro de agua desionizada.
Vortexee suavemente durante 30 segundos a un minuto. Después de 10 a 15 minutos, el gusano debería salir del agar hacia el agua desionizada. Tenga en cuenta que los gusanos son demasiado pequeños para verlos aquí con el fin de inmovilizar temporalmente los gusanos y un mililitro de cinco a 10 milimolar Lima.
Deje la solución y espere 10 minutos. Pipetee de cinco a 10 microlitros de muestra desde el fondo del vial y colóquelos entre dos laminillas. Esta muestra, que contiene un gran número de gusanos temporalmente inmovilizados, puede colocarse sobre el detector para iniciar la adquisición de datos.
Para fines de demostración, en esta sección se resumen los pasos de adquisición de imágenes para un experimento típico de tomografía óptica sin lentes o LOT; sin embargo, todo el proceso se ha automatizado mediante el uso de una interfaz personalizada desarrollada en LabVIEW. Para comenzar los pasos manuales, ajuste el ángulo inicial de la plataforma de rotación a menos 50 grados, donde cero grados corresponde a la posición vertical de la fuente de luz. Ajuste la posición inicial de la plataforma XY a cero cero, que es la posición de origen.
Ajuste el tiempo de exposición del detector para aprovechar al máximo su rango dinámico, de modo que la imagen sea lo más brillante posible sin que haya píxeles saturados, sin cambiar el ángulo de la plataforma de rotación. Capture nueve imágenes para cada imagen. Mueva la plataforma XY a una nueva posición en una cuadrícula cuadrada de tres por tres, de forma que cada imagen se desplace aproximadamente un cuarto de píxel con respecto a la anterior.
Adquirir más imágenes en cada ángulo podría mejorar la resolución, dependiendo del tipo de objeto y de la relación señal-ruido. Después de recopilar nueve imágenes en el ángulo inicial, ajuste la posición de la platina XY de regreso a la posición cero cero. Luego aumente el ángulo de la platina de rotación en incrementos de dos grados hasta alcanzar 50 grados positivos.
Después de cada incremento en cada nuevo ángulo, repita los pasos descritos. Los incrementos angulares pueden ser más finos o más gruesos, dependiendo de la optimización entre el tiempo de adquisición y la resolución de imagen. Tras la adquisición de datos, se obtiene un conjunto de 459 imágenes, que contienen nueve imágenes desplazadas por subpíxeles para cada uno de los 51 ángulos diferentes de iluminación.
Cada conjunto de nueve imágenes se procesa digitalmente mediante algoritmos de superresolución de píxeles para obtener una proyección de alta resolución. Luego, los resultados de superresolución de píxeles por holograma y ángulo se reconstruyen digitalmente para obtener 51 imágenes de proyección. El procesamiento de datos se muestra aquí utilizando una computadora portátil.
La reconstrucción tomaría menos de un segundo para todo el campo de visión utilizando unidades de procesamiento gráfico. Este conjunto de 51 imágenes de proyección se retroproyecta luego usando el complemento Tom OJA. Para Image J, las imágenes de proyección se cargan primero en Image J, tras lo cual se invoca el complemento Tom OJ.
Se carga en OJ una tabla de búsqueda que proporciona el ángulo de visión para cada imagen de proyección. Mediante el método de retroproyección ponderada, se pueden obtener imágenes tomográficas tridimensionales de la muestra. Aquí se demuestra el gran campo de visión de la tomografía óptica sin lentes, ya que la muestra se coloca directamente sobre la matriz de detectores. Las imágenes holográficas de los objetos se pueden registrar en un campo de visión de 24 milímetros cuadrados, el cual puede aumentarse aún más utilizando matrices de detectores emergentes con áreas activas más grandes.
Aunque el tamaño del píxel de la matriz de detectores limita la resolución de las imágenes holográficas grabadas, las técnicas de superresolución de píxeles mitigan este problema. Aquí se muestran hologramas con superresolución de píxeles, junto con las imágenes de proyección reconstruidas que ofrecen una resolución espacial submicrométrica para tres ángulos diferentes de iluminación. Las imágenes de proyección pueden combinarse utilizando técnicas de reconstrucción de imágenes tomográficas para calcular las tomografías del espécimen. Se muestran aquí tres imágenes en cortes en el plano XY a través de la parte anterior del gusano, donde el tubo faríngeo es visible únicamente en el corte correspondiente a Z igual a ocho micrómetros, tal como se espera de esta estructura aproximadamente cilíndrica con un diámetro exterior de aproximadamente cinco micrómetros.
Además, la imagen transversal en el plano XZ muestra claramente los límites del gusano y del tubo faríngeo en su interior, demostrando un éxito en la obtención de imágenes tridimensionales de la faringe. Con su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores realicen microscopía tridimensional en volúmenes de imagen de decenas de milímetros. Por lo tanto, la tomografía óptica sin lentes puede convertirse en una herramienta útil para aplicaciones de imágenes de alto rendimiento en plataformas de chips tipo Lebanon.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo trata sobre la tomografía óptica sin lentes, una técnica de microscopía tridimensional que permite la obtención de imágenes de alta resolución de especímenes biológicos. El método posibilita la obtención de imágenes en un volumen amplio, lo que la hace adecuada para su integración con plataformas de laboratorio-en-un-chip.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Imagen biológica
- Técnicas de microscopía
Antecedentes
- La tomografía óptica sin lentes proporciona una resolución espacial de <1 μm × <1 μm × <3 μm.
- La técnica es capaz de imaginar volúmenes entre 15-100 mm³.
- Es particularmente beneficiosa para aplicaciones en tecnologías de laboratorio sobre un chip.
- Este método utiliza iluminación parcialmente coherente para la formación de imágenes.
Objetivo del estudio
- Lograr imágenes tridimensionales sin lentes de especímenes biológicos.
- Explorar la integración de esta técnica con plataformas de laboratorio sobre un chip.
- Mejorar las capacidades de imagen en grandes volúmenes.
Métodos Utilizados
- Colocación de la muestra directamente sobre el chip sensor.
- Uso de iluminación parcialmente coherente.
- Desplazamiento lateral de la fuente de luz para registrar imágenes holográficas con desplazamiento subpíxel.
- Registro de múltiples imágenes holográficas para imágenes tomográficas.
Resultados principales
- Imágenes exitosas de especímenes biológicos en tres dimensiones.
- Demuestra capacidades de alta resolución espacial.
- Integración efectiva con plataformas de laboratorio en un chip.
- Validación del método mediante diversas pruebas de imagen.
Conclusiones
- La tomografía sin lentes es una técnica prometedora para la imagen biológica.
- El método ofrece ventajas significativas en resolución espacial y volumen de imagen.
- Las aplicaciones futuras podrían expandirse a diversos campos de la investigación biológica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microscopía tomográfica sin lentes y basada en chip permite la obtención de imágenes 3D de alta resolución, sin marcado y de gran volumen, de especímenes biológicos, sin necesidad de óptica voluminosa, lo que facilita su integración con plataformas microfluídicas y de laboratorio en un chip. Este enfoque reduce el tamaño y el costo del instrumento, manteniendo una resolución submicrométrica, y aborda los cuellos de botella en la etapa de descubrimiento relacionados con el rendimiento de la muestra y la compatibilidad de los ensayos. La tecnología mejora la confianza predictiva en la validación temprana de objetivos al proporcionar datos estructurales cuantitativos con resolución en profundidad para la selección fenotípica y la reducción mecanicista de riesgos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización tridimensional de fenotipos celulares y orgánulos subcelulares.
- Valor operativo: Facilita la obtención de imágenes sin marcadores en especímenes vivos, reduciendo artefactos de preparación y preservando la biología nativa para estudios de interacción con el blanco.
- Valor predictivo: Genera datos volumétricos cuantitativos para aclarar el mecanismo de acción y reducir los riesgos asociados a las vías del blanco en las fases iniciales del descubrimiento.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona imágenes 3D con resolución submicrométrica en grandes campos de visión, lo que permite cribado fenotípico de alto contenido de microorganismos y poblaciones celulares.
- Valor operativo: Elimina la necesidad de lentes y óptica compleja, estandarizando los flujos de trabajo de imagen para el desarrollo de ensayos reproducibles y escalables.
- Preparación para ensayos: Facilita la preparación de sistemas biológicos validados para la evaluación de compuestos posteriores mediante la adquisición automatizada de datos de alto rendimiento.
Investigación Translacional y Preclínica
- Continuidad traslacional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al proporcionar imágenes 3D consistentes en sistemas modelo como C. elegans y embriones de pez cebra.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Permite el seguimiento longitudinal de cambios estructurales en sistemas relevantes para enfermedades, apoyando la alineación de biomarcadores y decisiones de avance ajustadas al riesgo.
- Fidelidad del modelo preclínico: Conserva la arquitectura y dinámica tisular nativas, mejorando la trasladabilidad de los hallazgos desde contextos in vitro a in vivo.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la biología inicial hasta la identificación de compuestos activos, apoyando la comprobación de hipótesis, la estandarización de ensayos y los análisis cuantitativos sin necesidad de procesamiento extenso de muestras ni etiquetado.
- Biología de Descubrimiento: Permite la comprobación de hipótesis y la clarificación de vías mediante la visualización 3D de fenotipos estructurales en sistemas biológicos no perturbados.
- Selección: Proporciona imágenes listas para ensayos, reproducibles y con resultados cuantitativos para comparar condiciones de control y tratamiento en grandes poblaciones de muestras.
- Análisis: Genera reconstrucciones tomográficas resueltas por profundidad e imágenes de proyección que facilitan la comparación estadística de características morfológicas.
- Investigación Translacional: Aporta continuidad preclínica mediante la obtención de imágenes de organismos modelo relevantes para enfermedades, con resolución y cobertura volumétrica constantes.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma de imagen reutilizable, compatible con diversos tipos de muestras y formatos microfluídicos, reduciendo la inversión tecnológica redundante.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva mediante imágenes 3D de alta resolución sin etiquetado que reducen la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y escalabilidad mediante un diseño sin lentes, adquisición automatizada y compatibilidad con matrices de sensores de gran formato.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir la detección temprana de anomalías fenotípicas, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas y la ineficiencia de capital.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos cuantitativos de imágenes multiparamétricas para la comparación objetiva de candidatos terapéuticos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en imágenes computacionales, holografía y algoritmos de reconstrucción tomográfica.
- Depende de matrices de sensores CMOS de alta resolución y etapas de iluminación motorizadas para la captura de datos en múltiples ángulos.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de iluminación, ajustes de exposición y procedimientos de desplazamiento subpíxel para garantizar la reproducibilidad.
- La adaptación a diferentes sistemas modelo puede requerir la optimización de las técnicas de preparación e inmovilización de muestras para mantener la viabilidad durante la adquisición de imágenes.
- Las limitaciones prácticas incluyen la sensibilidad a los índices de refracción y propiedades de dispersión de la muestra, lo que puede afectar la relación señal-ruido en especímenes densos o altamente absorbentes.
