La cuantificación de la actividad de Cis Elementos reguladores en la retina del ratón por electroporación explante

El objetivo general de este procedimiento es electrooporar implantes retinianos de ratón con reporteros transcripcionales fluorescentes y cuantificar sus niveles de expresión. Esto se logra primero aislado el tejido retiniano de ratón neonato mediante disección. El segundo paso del procedimiento consiste en electrooporar la retina con constructos de reporteros de ADN fluorescentes.

El tercer paso del procedimiento consiste en cultivar las retinas electroporadas como implantes durante ocho días. El paso final del procedimiento es cosechar el explante retiniano y cuantificar los niveles de expresión de los reporteros fluorescentes. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran los niveles relativos de expresión de diferentes constructos de promotor con reportero en la retina en desarrollo del ratón mediante electroporación de explantes retinianos, seguida de un análisis cuantitativo de datos.

Mi nombre es Joe Corbo y soy miembro del personal académico del Departamento de Patología e Inmunología en la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington en St. Louis. Hoy presentaremos un protocolo en video que demuestra la técnica de electroporación X explante en retinas de ratones recién nacidos, con el fin de cuantificar la actividad de elementos reguladores cis específicos de fotorreceptores, y este protocolo será demostrado por una estudiante de posgrado de mi laboratorio, Cindy Montana. Primero, esterilice la cámara de electroporación y todos los instrumentos con etanol al 70 % en preparación para la recolección de los ojos.

Desinfecte ambos guantes y la superficie de trabajo con etanol y mantenga condiciones estériles durante todo el procedimiento. A continuación, en una cabina de cultivo celular, pipetee seis mililitros de medio de disección en una placa de Petri estéril de 60 milímetros y tres mililitros de medio en dos placas estériles de 35 milímetros. De regreso en la superficie de trabajo, desinfecte la cabeza y el cuello de un ratón recién nacido con etanol al 70%.

Después de decapitar rápidamente la cabeza con tijeras, transfiera la cabeza a una placa estéril de 100 milímetros, corte el cuero cabelludo con tijeras pequeñas para exponer los ojos bajo un microscopio de disección. Usando pinzas curvas, retire suavemente el ojo de la órbita y luego coloque el ojo en una placa de 35 milímetros que contenga medio de disección. Continúe recolectando ojos de manera que haya de tres a cuatro ojos por alícuota de ADN que se va a electropermeabilizar, manteniendo los ojos y el medio de disección a temperatura ambiente hasta finalizar.

Desinfecte tanto una hoja de bisturí como el envoltorio de una pipeta de transferencia de plástico estéril con etanol al 70 %, y luego use la hoja de bisturí para cortar la punta de la pipeta lo suficientemente alto como para poder pipetear un ojo completo. Utilizando la pipeta ensanchada, transfiera un ojo desde la placa de 35 milímetros a la placa de 60 milímetros bajo un microscopio estereoscópico con aumento alto. Use pinzas finas para eliminar cualquier tejido, como los músculos extraoculares y la grasa, de la superficie del ojo.

Luego, retire el nervio óptico pellizcándolo en la base. Para aislar la retina, haga un pequeño orificio en la esclerótica en el limbo; la esclerótica y el epitelio pigmentario de la retina aparecen brillantes en comparación con el tejido retiniano, que es gris mate. Introduzca un extremo de ambas pinzas en el orificio y desgarre suavemente la esclerótica y el EPR.

Asegúrese de dejar la lente en su lugar. Utilice la pipeta ensanchada para transferir la retina diseccionada al segundo recipiente de 35 milímetros que contiene medio. Recolecte todas las retinas y almacénelas en un incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius.

Hasta la electroforesis, trabajando en una campana de cultivo de tejidos para cada ADN Eloqua que se vaya a electrofectar, llene un plato estéril de 35 milímetros con medio de disección y un segundo plato con medio de cultivo. Utilizando una pipeta P200, lave los compartimentos del plato de electroforesis con 1X PBS estéril tres veces. Llene los compartimentos con las alícuotas de ADN de 60 microlitros y llene cualquier compartimento no utilizado con 60 microlitros de 1X PBS.

Conecte los electrodos al platillo de electroforesis e introduzca la configuración adecuada en el electro. Utilice pinzas finas para sujetar las retinas por el cristalino y transfiéralas a las cámaras de electroforesis. Coloque hasta cuatro retinas en cada cámara.

Coloque las retinas de manera que el cristalino quede apoyado contra la barra metálica unida al electrodo positivo. Limpie las pinzas entre cada cámara para evitar la transferencia de ADN de una cámara a la siguiente. Una vez que todas las retinas estén alineadas, presione inicio en el electro.

Deberían formarse burbujas diminutas en la barra metálica unida al electrodo negativo. Desconecte los electrodos y apague el electro con pinzas. Mueva suavemente las retinas lejos de las paredes de la cámara.

Transfiera las retinas desde las cámaras a las placas de 35 milímetros que contienen medio de disección. Utilizando una pipeta estéril de transferencia, transfiera las retinas desde el medio de disección a las placas de 35 milímetros que contienen medio de cultivo. Etiquete los pocillos de una placa de cultivo estéril de seis pocillos y agregue tres mililitros de medio de cultivo a cada uno.

Utilice pinzas estériles para colocar suavemente filtros redondos Watman Nucleo sobre el medio en cada pocillo, con el lado brillante de los filtros orientado hacia arriba. Con ayuda de un microscopio estereoscópico, transfiera una retina individual al filtro mediante una pipeta de transferencia estéril, con el lado del cristalino hacia abajo. Si la retina queda depositada con el lado del cristalino hacia arriba, súbrala nuevamente con la pipeta y repita el procedimiento.

No coloque más de cuatro retinas en cada pocillo y manténgalas en gotas separadas. Una vez que las retinas hayan sido colocadas en los pocillos, traslade la placa de cultivo a un incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius y cultívelas durante el tiempo deseado. Por lo general, a los ocho días se observan resultados exitosos de electroporación, con expresión del constructo de ADN en desde un cuarto hasta un tercio de la superficie retiniana.

Los niveles de fluorescencia se cuantifican comparando regiones uniformemente electro poradas que expresan el constructo CRE con regiones fuera de la retina, y luego se normalizan respecto a la expresión control de GFP. En particular, los fotorreceptores en bastón se transducen eficientemente, como se muestra. A continuación se presentan los resultados de una electro poración en la que dos promotores específicos de bastones dirigen la expresión de GFP y DS Red en la capa nuclear externa.

Al superponer los dos patrones de expresión con la tinción de DPI mostrada aquí en azul, se aprecia claramente la expresión específica en los fotorreceptores. No se observa expresión en la capa intermedia ni en la capa de células ganglionares. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo diseccionar, registrar y cultivar explantes retinianos de ratón con el fin de cuantificar la actividad de elementos reguladores de la ciste retiniana.

Gracias por ver el video y mucha suerte con sus experimentos.