Transferencia de genes a la oreja del ratón en desarrollo por el interior

Jane se transfirió al oído interno de ratón en desarrollo mediante electroporación in vivo de Ling Wang, Han Jang y John Burgandy, Centro de Investigación de la Audición de Oregón, Universidad de Ciencias de la Salud de Oregón. Está bien. Mi nombre es John Burgandy. Mi laboratorio está en el Centro de Investigación de la Audición de Oregón de la Universidad de Ciencias de la Salud de Oregón.

Mi nombre es Ang. Soy investigador en el laboratorio de Johns. También soy Ang en el laboratorio de Johns como asistente de investigación.

Nuestra presentación se divide en cuatro partes. La primera es la laparotomía ventral. Demostramos el uso del pentobarbital sódico como anestesia, cómo evaluar la adecuación de la anestesia, la protección corneal, la preparación del sitio quirúrgico, la desinfección, la hoja de datos para cirugía experimental en ratones con supervivencia, el conjunto quirúrgico, la incisión media ventral a través de la piel y la pared abdominal, y la exteriorización de los cuernos uterinos.

La segunda parte es la microinyección transuterina. Demostramos la transiluminación del embrión, la reorientación del embrión, la microinyección, la fabricación de pipetas y la microinyección en el oído interno en el día embrionario 11,5 y en el día embrionario 12,5. La tercera parte es la electroforesis in vivo.

Demostramos la colocación de electrodos de estilo paleta y la electroporación del oído interno del ratón en el día embrionario 11,5. La parte cuatro muestra resultados representativos. Mostramos la expresión de GFP en cócleas embrionarias tardías y posnatales tempranas.

Que resultó de la electroforesis in vivo del Otis con un plásmido de expresión en el día embrionario 11,5, parte uno de laparotomía ventral. La hembra se sostiene firmemente agarrando la piel detrás del cuello, la cola y la pata trasera izquierda. Se administra una inyección intraperitoneal de anestésico a base de pentobarbital sódico tras limpiar el abdomen con etanol al 70 %.

El ratón se coloca dentro de su jaula de origen durante cuatro a cinco minutos para permitir que el anestésico haga efecto. Se utilizan pellizcos en la pata y en la cola para evaluar la adecuación de la anestesia. Esta hembra reacciona ante el pellizco en la cola y necesita dos minutos más antes de dejar de responder a estímulos nocivos.

Se aplica una pomada oftálmica estéril en los ojos para proteger las córneas de la desecación. Preparamos el sitio quirúrgico en una campana extractora de gases para minimizar la dispersión de pelo y caspa. El pelo se afeita con una cuchilla fina para exponer la piel que cubre la pared abdominal.

La eliminación completa del pelo facilita la cicatrización de la incisión en el período posoperatorio. La desinfección de la piel abdominal se realiza mediante pasadas alternadas de etanol al 70% y Betadine, seguidas de etanol al 70%. Siempre se debe pasar de la parte rostral hacia la caudal utilizando una bola de algodón quirúrgico nueva o un aplicador con punta de algodón.

Para cada pasada, evaluamos la profundidad y calidad de las respiraciones durante la desinfección para asegurar que la hembra esté inconsciente. Tras la segunda pasada con etanol al 70 %, colocamos inmediatamente la superficie ventral de la hembra hacia abajo sobre un campo estéril y la colocamos sobre una almohadilla térmica durante dos o tres minutos para calentarla. Este es un momento conveniente para registrar los datos preoperatorios en la hoja de registro de cirugía superviviente en ratón. Hemos adjuntado nuestra hoja de datos de cirugía superviviente en ratón como información complementaria.

Considere incluir la hoja de datos y su protocolo de cuidado de animales para que el comité institucional de cuidado y uso de animales pueda ver cómo monitoreará los datos preoperatorios, operatorios y posoperatorios. Completamos una hoja de registro para cada sujeto quirúrgico. Preferimos realizar la cirugía en un ambiente estéril, aunque esto normalmente no es necesario para roedores.

La superficie de trabajo está separada del motor del soplador y de la carcasa del plenum, por lo que no se transmite ninguna vibración al usuario. Durante la microinyección, hemos adjuntado como información complementaria un esquema de las modificaciones que realizamos a nuestra campana de flujo laminar para facilitar la transferencia génica in utero; los cambios esenciales son aberturas de bajo nivel para iluminación de pista y tomas ocultas para los cables de alimentación de los instrumentos, así como una ruta para el paso de circuitos eléctricos auxiliares. El conjunto quirúrgico consta de la bolsa de suero fisiológico con lactato eléctrico, baño tibio, manipulador X, Y, Z, microscopio estereoscópico con fluorescencia, fuente de luz de fibra óptica y los instrumentos quirúrgicos.

Los pedales de pie se utilizan para activar el microinyector, el electrodo y el enfoque. Los instrumentos quirúrgicos del microscopio se esterilizan en un autoclave. Los instrumentos deben volver a esterilizarse entre ratones utilizando un esterilizador de perlas de vidrio o reautoclavando el portaagujas.

Los tijeras bola, pinzas de anillo y pinzas vasculares son las herramientas esenciales. Realice una incisión en la línea media ventral, sujete la piel con las pinzas vasculares y extirpe el tejido conjuntivo con las tijeras de punta redondeada; extienda la incisión entre 10 y 14 milímetros. Identifique la banda blanca avascular de tejido conectivo llamada línea alba y en la línea media ventral del abdomen, incise la línea alba con las tijeras de punta redondeada.

Teniendo cuidado de no lesionar el intestino ni las almohadillas de grasa inguinales. Irrigue inmediatamente el abdomen con solución estéril de Ringer lactato precalentada. Evalúe los sitios de incisión en la piel y la pared abdominal en busca de sangrado.

La presión directa con pinzas romas detendrá cualquier sangrado menor presente; exteriorice los cuernos uterinos derecho e izquierdo con pinzas de punta anular. Sujete suavemente el cuerno uterino derecho con un extremo anular de la pinza y desplace el útero hacia la incisión de la línea media. Utilice la mano libre para manipular suavemente el lado lateral de la hembra y facilitar el enganche del útero.

Las fórceps nunca se utilizan para comprimir el útero y extraerlo. Dado que esto podría dañar la vasculatura uterina o los embriones, repita el procedimiento de exteriorización para el cuerno uterino izquierdo. Inmediatamente irriague los cuernos uterinos recién exteriorizados con solución de Ringer con lactato precalentada y vuelva a insertar suavemente las almohadillas grasas o los intestinos si estos se exteriorizan junto con el útero.

Esto no se encuentra con frecuencia. Segunda parte: microinyección uterina. La hembra se coloca debajo del objetivo de larga distancia de trabajo y se coloca una luz de fibra óptica con cable flexible contra la pared uterina.

El útero se presiona suavemente con un dedo de la mano libre. Para facilitar la identificación de la orientación del embrión. La luz del cable de fibra óptica debe estar en la intensidad más baja necesaria para evaluar con precisión la orientación del embrión.

La luz intensa puede transmitir calor al útero, lo que podría causar complicaciones. Sostenemos la luz de fibra óptica y el útero con una mano y utilizamos un dedo de la otra mano para reposicionar el embrión mediante palpación suave. Demostramos en los siguientes tres videos mediante microscopía clips EC y las orientaciones embrionarias comunes observadas dentro del útero.

El espectador verá la vista microscópica que observamos durante la transiluminación, aunque en blanco y negro; la transiluminación del útero permite detectar la orientación del embrión in vivo. En este ejemplo, el embrión se encuentra en posición de cabeza abajo, con su superficie ventral orientada hacia el espectador. Al mover el útero hacia adelante y hacia atrás, podemos identificar las extremidades posteriores derecha e izquierda, la cola y el ojo izquierdo del cefalón.

En este ejemplo, el embrión se encuentra nuevamente en posición de pararse sobre la cabeza, pero girado aproximadamente 90 grados con respecto al eje anterior-posterior. Al mover suavemente el útero hacia adelante y hacia atrás, podemos observar las formas de pala que definen la extremidad trasera izquierda y la extremidad delantera izquierda. El cerebro posterior también es evidente.

El embrión está en posición vertical con su lado izquierdo orientado hacia el observador. El cuarto ventrículo en formación es visible como una mancha brillante en el cerebro posterior. También son evidentes el cefalón del ojo izquierdo, la cuarta extremidad izquierda y las extremidades posteriores izquierdas.

Una presión suave sobre el útero reorienta ligeramente a los embriones, lo que permite detectar el tronco principal de la vena cefálica primaria y sus ramas anterior y posterior, que se marcan con un asterisco blanco y negro, respectivamente. Como veremos, el Otis se encuentra a mitad de camino entre las ramas anterior y posterior de la vena cefálica primaria. El Otis en sí no puede verse a través del útero mediante transiluminación.

Demostramos en dos clips sucesivos de microscopía de video cómo reorientar el embrión para la microinyección en el Otis assist. El objetivo es identificar los puntos de referencia embriónicos que permiten interpolar la ubicación del otis en la cabeza lateral. Mesen con, nuestro objetivo es reorientar el embrión desde la posición dorsal a la lateral para poder identificar la vena principal de la cabeza.

El mesencéfalo, el cuarto ventrículo y la extremidad izquierda son evidentes en la posición dorsal. Una presión suave sobre el útero cambia la orientación del embrión de dorsal a lateral. El ojo izquierdo, el cefalón, el mesencéfalo y el cuarto ventrículo son fácilmente aparentes.

La vena cefálica principal y su rama posterior indicadas por el asterisco también son evidentes. La rama anterior de la vena cefálica principal no se detecta con claridad. Nuestro objetivo, nuevamente, es orientar el embrión para que permita identificar la vena cefálica principal, pero con un aumento mayor apropiado para la microinyección uterina.

Las arterias uterinas, la banda decidual y el ojo izquierdo se observan en esta perspectiva lateral. Una presión suave sobre el útero cambia la posición del embrión, lo que nos permite detectar el cuarto ventrículo del ojo izquierdo. La vena cefálica primaria y su rama posterior marcada con el asterisco, la vena cefálica primaria y sus ramas forman la forma de los postes de fútbol americano.

La vesícula ótica no se puede ver a través del útero, pero se encuentra en el centro de las estructuras verticales. Lynn ha iniciado una secuencia de inyección para un embrión. Ella transilumina el útero, reorienta el embrión para una microinyección y introduce en el campo la pipeta de microinyección cargada con verde rápido.

La pipeta de microinyección está conectada a un porta-pipetas que es sostenido por un micromanipulador X, Y, Z. El soporte magnético del micromanipulador está fijado a una placa de acero con una base de teflón que permite un posicionamiento general sin esfuerzo de la pipeta de microinyección. La aguja se avanza utilizando el botón de control micrométrico frontal del micromanipulador de forma adecuada.

Las pipetas fabricadas son esenciales para realizar una microinyección poco traumática en el embrión de ratón en estadio temprano de Otis. Tiramos de tubos capilares de vidrio borosilicatado de pared gruesa con un extractor horizontal de pipetas. La pipeta resultante que se muestra en A se rompe manualmente con pinzas en la posición de diámetro externo de aproximadamente 14 a 16 micrones indicada por la cabeza de flecha en B. La rotura irregular de la pipeta mostrada en C es dentada y frágil.

Se bisela la pipeta aproximadamente a 20 grados para afilar la punta de la pipeta, como se observa en el panel D; los parámetros para el tirado y el biselado de las pipetas de microinyección se proporcionan en el texto adjunto. Demostramos en los dos siguientes clips de microscopía por video la microinyección en el otocisto de ratón en los días embrionarios 11,5 y 12,5. Nuestro objetivo es demostrar la microinyección uterina en el otocisto de ratón del día embrionario 11,5.

Primero, inyectamos los óticos sin la presencia del útero para mostrar de forma inequívoca cómo se ve una inyección correctamente dirigida. Luego, demostramos una auténtica microinyección transuterina. Para esta primera inyección, se realizó una incisión en el útero para permitir que la vesícula visceral sobresaliera; se eliminó la banda decidua que recubría el saco vitelino visceral.

La placenta permanece adherida al útero y el embrión está vivo. Con el útero removido focalmente, observamos el cuarto ventrículo, la vena principal de la cabeza y sus ramas anterior y posterior, la pipeta y la ubicación aproximada del quiste en blanco. Al inicio de esta secuencia de inyección, se detecta flujo sanguíneo en la vasculatura del saco vitelino visceral.

La pipeta se avanza a través del saco vitelino visceral y se inyecta dai en la nota osis, el conducto linfático dorsalmente y la posición de los otic en el centro de los montantes. Los otic se encuentran a mitad de camino entre las ramas anterior y posterior de la vena cefálica primaria; la microinyección uterina en el día embrionario 11.5 de los otic murinos requiere la detección de la vena cefálica primaria y al menos una de sus ramas para estimar la ubicación del otic assist.

Nuestro objetivo en este ejemplo esquemático es que tanto la rama anterior como la posterior de la vena cefálica primaria se detectan con el territorio de la OUC marcado en blanco. Una presentación más realista del embrión es aquella en la que se detecta el tronco principal de la vena cefálica primaria junto con solo una de sus ramas, y en el ejemplo mostrado solo se observa la rama posterior de la vena cefálica primaria, pero eso es suficiente para interpretar la ubicación de los otocistos. El PT se avanza a través del útero y se inyecta colorante en los otocistos.

Esperamos 30 segundos para permitir que el colorante se limpie de la cavidad amniótica, momento en el cual podemos observar dorsalmente el conducto endolinfático y el vestíbulo. Concluimos con una vista de baja magnificación del embrión cuyo quiste acabamos de inyectar, para proporcionar una perspectiva anatómica; en esta imagen, se observan el cuarto ventrículo, el ojo izquierdo y la vasculatura uterina. Demostramos la transinyección y microinyección en el quiste ótico de ratón en el día embrionario 12, así como la microinyección en el incipiente cuarto ventrículo del encéfalo posterior.

La transiluminación nos permite detectar la vena cefálica principal en esta vista lateral izquierda, así como el ojo. Se avanza la pipeta a través del útero hasta la vesícula ótica y se inyectan los colorantes para llenar su luz. Para inyectar el cuarto ventrículo, rotamos el embrión 90 grados para obtener una vista dorsal del encéfalo posterior.

El quiste inyectado izquierdo ahora está en el lado izquierdo. La pipeta se avanza a través del útero y el verde rápido se mezcla con lor. Se inyecta dextrano conjugado en el cuarto ventrículo.

Tenga en cuenta que el volumen de colorante inyectado no penetra en el mesencéfalo in vivo. Se evalúa la fluorescencia después de la inyección para validar la localización de la dextrana en el cuarto ventrículo. Luego, el embrión se reorienta desde la posición dorsal a la lateral.

El conducto linfático endógeno se encuentra justo ventral al cuarto ventrículo en esta vista lateral. La fluorescencia in vivo valida la localización del dextrano en el cuarto ventrículo. Al nacer, examinamos a las crías en busca de fluorescencia verde en el cuarto ventrículo utilizando una fluorescencia epiluminiscente.

Los cachorros observados bajo microscopio de disección que presentan fluorescencia verde en sus cerebros posteriores poseen un oído interno que fue manipulado durante la embriogénesis, parte tres, electroforesis in vivo. Después de llenar el quiste con el plásmido de expresión, el útero se irriga nuevamente con solución de Ringer lactatada precalentada. La transiluminación facilita centrar el quiste ODU en el campo del electrodo.

La punta metálica de la luz de fibra óptica se retrae de la superficie uterina. Antes de iniciar el tren de pulsos cuadrados, demostramos en el siguiente clip de microscopía de video un ciclo completo de electropermeabilización in vivo. La electropermeabilización del quiste ótico de ratón en el día embrionario 11.5 requiere la colocación suave de los electrodos de tipo paleta sobre el útero.

En este ejemplo, el quiste ótico izquierdo se ha llenado con un plásmido de expresión y el útero se ha irrigado recientemente con solución de Ringer lactatada. El cátodo se coloca lateralmente con respecto al quiste ótico lleno y el ánodo se posiciona medialmente al inicio de la secuencia de estimulación; el quiste ótico queda centrado en el campo del electrodo de paleta. El útero se comprime suavemente y se inicia la serie de pulsos de onda cuadrada mediante un interruptor de pedal.

Idealmente, se administra de 60 a cien miliamperios de corriente por pulso. Luego se suelta el útero y se irriga inmediatamente. El útero recién irrigado se devuelve a la cavidad abdominal mediante una presión suave con la pinza de anillo.

Una vez que el útero está interno, la cavidad abdominal se enjuaga con aproximadamente cuatro mililitros de solución de Ringer con lactato, dejando alrededor de un mililitro de solución de Ringer con lactato en la cavidad abdominal para ayudar a mantener la hidratación de la hembra, que beberá menos agua de lo habitual inmediatamente después de la cirugía abdominal. La pared abdominal y luego la piel se cierran con sutura reabsorbible utilizando un portaagujas. Nuestro portaagujas tiene una tijera integrada que simplifica el cierre.

Preferimos un punto de sutura continuo tanto para la pared abdominal como para la piel. Fijamos cada dos puntos para proporcionar un soporte adicional en el sitio de la incisión. Administraremos un medicamento antiinflamatorio no esteroideo por vía subcutánea antes de colocar al animal en la jaula de recuperación.

Consulte con su personal veterinario sobre cuáles analgésicos profilácticos son preferidos por el comité institucional de cuidado y uso de animales. La hembra se coloca sobre una sábana estéril y se ubica en el piso de la jaula de recuperación calentada. La jaula de recuperación contiene material para anidación, un tubo rojo para cobertura, alimento para laboratorio y una botella de agua.

La jaula se vuelve a armar con una tapa filtrante en la parte superior a la mañana siguiente a la cirugía. La hembra está bien arreglada, ambulatoria y capaz de mantener el equilibrio sobre sus miembros posteriores para investigar la parte superior abierta de la jaula. La línea de sutura en el abdomen está limpia, seca y no muestra signos de separación, enrojecimiento ni hinchazón.

Hemos adjuntado un documento que aborda el desarrollo de protocolos de cuidado animal para la transferencia génica in utero. El documento contiene redacción que puede resultar útil al diseñar un protocolo específico de la institución, en consulta con su comité de cuidado y uso de animales. Parte cuatro, resultados representativos.

Los paneles A y B muestran resultados representativos de una cóclea representativa de un cachorro del sexto día postnatal cuyo oído interno fue inyectado con un plásmido de expresión de proteína verde fluorescente mejorada en el día embrionario 11,5 y luego electro. Se retiró la pared lateral de la cóclea del tramo medio y el ápice. Solo se observa expresión de GFP desde la base hasta el tramo medio de la cóclea, siguiendo la distribución del marcador de células ciliadas miosina siete A mostrado en el panel B. El panel C muestra una proyección confocal de baja magnificación del día embrionario.

18,5 órganos auditivos de ratón inmunomarcados con un anticuerpo contra la miosina siete A; las células transfectadas se distribuyen a lo largo del órgano auditivo. El panel D muestra una proyección confocal de alta magnificación del día embrionario 18,5 del órgano auditivo de ratón teñido con cin.siete.

Se detecta expresión de GFP en las células ciliadas internas y externas, células interfalángicas, células pilares y células TER. La transferencia génica mediada por electroforesis al oído interno en el día embrionario 11,5 transfecta progenitores que dan origen a todos los tipos celulares componentes del órgano de Corti.