ReAsH / Flash etiquetado y análisis de imágenes de las proteínas en las células del sensor Tetracysteine

El objetivo general de este procedimiento es etiquetar células que expresan una proteína marcada con tetra cisteína y con un marcador fluorescente mediante los colorantes flash o ash, y analizar cuantitativamente los resultados. Esto se logra primero transfectando un plásmido que porta una proteína fluorescente y la proteína diana que contiene una etiqueta de tetra cisteína en la línea celular de interés. A continuación, la proteína expresada se etiqueta con R o flash, y se elimina mediante lavados con BAL el colorante unido de forma no específica para preparar la muestra para la obtención de imágenes microscópicas.

Luego, se utiliza un microscopio confocal para obtener imágenes fluorescentes de las células mediante los canales de ash o flash y de la proteína fluorescente. Finalmente, las imágenes se analizan mediante ImageJ para cuantificar la unión de ash o flash a la proteína diana. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren el grado de unión de ash o flash a la proteína diana en las células, mediante la correlación entre la fluorescencia de ash y la fluorescencia de la proteína fluorescente.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como simplemente tomar la proteína diana con GFP, es que permite rastrear una segunda propiedad de la proteína, tal como un cambio conformacional, además de su localización. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la subestructura y función de proteínas, tales como eventos de oligomerización, cambios conformacionales y eventos de unión de LI que alteran la capacidad del TAC para unirse o disociarse. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando quisimos evaluar cómo se formaban en las células pequeños agregados submicroscópicos poligamos de la metahuntingtina.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que el paso de análisis de datos es difícil de aprender debido a su complejidad técnica. Se demostrarán los procedimientos experimentales. Los pasos uno a tres serán realizados por Yasmin Ranson, una asistente de investigación de nuestro laboratorio, quien demostrará el análisis de datos. El paso cuatro será realizado por Sevki GaN, un estudiante de posgrado de nuestro laboratorio, utilizando métodos estándar de cultivo celular para su línea celular de interés y una placa para microscopía de células vivas lista para la transfección.

Prepare un cultivo de células adherentes y transfecte su plásmido que contiene el gen de interés con la etiqueta TC. Según el método de transfección elegido, es importante incluir controles positivos y negativos para evaluar el grado de unión específica a las etiquetas TC, así como para evaluar la difusión de fluorescencia entre canales al obtener micrografías confocales. Por lo tanto, para dos colores, asegúrese de preparar muestras con un solo color, ya sea la proteína fluorescente por sí sola y, si es posible, una proteína T ctech unida a flesh o frente a vs.

Pero sin una proteína fluorescente. Uno o dos días después de la transfección, enjuague suavemente las células con 300 microlitros de solución salina balanceada de Hank (HBSS) precalentada, prepare HBSS fresca precalentada con 10 micromolar, uno, dos, etanoditiol o EDT y un micromolar de flash o ash. Y tras eliminar el HBSS de las células, reemplace suavemente con 300 microlitros del medio ash e incube exactamente durante 30 minutos a 37 grados Celsius en un incubador de cultivo de tejidos.

En nuestra experiencia, tiempos de incubación más largos aumentan significativamente la fluorescencia de fondo. Aspire suavemente la solución de marcado de las células y sustitúyala con 300 microlitros de HBSS precalentado con 250 micromolar, dos tres dímero, cap propanol o BAL durante 15 minutos a 37 grados Celsius. Retire la solución de lavado mediante aspiración suave y sustitúyala con 300 microlitros de HBSS precalentado.

Después de este lavado, las células pueden fijarse con paraform aldehído, aunque encontramos que esto aumenta la fluorescencia inespecífica cianina. Por lo tanto, por lo general realizamos imágenes de las células vivas a temperatura ambiente. Además, la fijación de las células antes del marcado impide la unión del colorante bial.

Para comenzar a obtener imágenes de células en el microscopio confocal, configure los parámetros para la obtención de imágenes de los fluoróforos individuales y asegúrese de que haya una fuga despreciable entre los canales. A continuación, ajuste la configuración del fotomultiplicador de modo que la fluorescencia máxima en la muestra no sature el detector. Una vez determinadas las mejores condiciones de obtención de imágenes, no cambie ninguno de estos parámetros entre muestras.

Utilice una velocidad de escaneo de 200 hercios, recolecte cuatro promedios de línea y ajuste el diámetro del pinhole a una unidad de área. El diámetro del pinhole puede ampliarse si existe un problema con la relación señal-ruido. Sin embargo, esto podría provocar cierta pérdida de resolución de imagen.

Recolecte las imágenes confocales en un formato de 12 bits o superior, si es posible, para maximizar la calidad del análisis cuantitativo de datos. Recolecte imágenes para el canal de la proteína fluorescente y también para el canal del colorante del arsenal BI para todas las muestras.

Para analizar los datos, utilice el software Image J con los siguientes complementos. Si utiliza una versión de Image J anterior a la versión 1.32 C, haga clic en las siguientes opciones. Para permitir que varias imágenes se abran al mismo tiempo, edite las opciones de entrada barra salida, marque la casilla para usar el selector de archivos j para abrir barra compartir.

Haga clic en aceptar. Abra las imágenes de interés. Image J definirá automáticamente las intensidades máximas y mínimas de píxeles que se muestran en la pantalla para cada imagen por separado, ya que diferentes imágenes tendrán distintas intensidades de píxeles.

Esto significa que las imágenes mostradas no son comparables tal como se ven. Para asegurar que las imágenes abiertas estén todas en la misma escala, defina físicamente las intensidades de píxeles superior e inferior que se mostrarán. Para establecer estos valores, elija la imagen y ajuste el brillo y el contraste.

Haga clic en establecer, defina los valores mínimos y máximos que se mostrarán. Luego, elija propagar a todas las imágenes abiertas y haga clic en aceptar. Alternativamente, coloque todas las imágenes de un canal determinado juntas en un solo archivo o pila.

Image J ajustará automáticamente todas las imágenes a la misma escala. Para hacerlo, elija pilas de imágenes imágenes para apilar, ingrese un nombre común a cada archivo y seleccione usar títulos como etiquetas. Haga clic en aceptar.

Convierta todas las imágenes abiertas a 8 bits para el análisis. Al seleccionar el tipo de imagen de 8 bits, esto reescalará el rango visualizado a un intervalo de cero a 255. Es importante no sobrescribir el formato original de 12 bits o superior, ya que esto provocaría pérdida de contenido informativo.

Guarde una copia en una nueva carpeta llamada eight bit converted utilizando la opción guardar como. Un método para examinar el grado de unión del colorante bi arsal en una imagen completa es realizar un gráfico de correlación de intensidad de píxeles. Este gráfico muestra el valor de cada píxel en un canal en relación con el valor del píxel correspondiente en un segundo canal.

Por lo tanto, una posición de píxel con alta fluorescencia de GFP también presentará alta fluorescencia de ceniza si existe una unión elevada. Para analizar la co-correlación de píxeles, asegúrese de que las imágenes de GFP y REA de ocho bits estén abiertas en ImageJ. A continuación, abra el complemento Image Correlator seleccionando Plugins > Image Correlator. Asigne los archivos de imagen a la imagen uno y la imagen dos.

Luego haga clic en aceptar. La pila resultante puede no mostrar ninguna información detallada. Esto es normal.

Guarde la pila en una nueva carpeta llamada gráficos de dispersión y asígnele el mismo nombre de archivo que la muestra a la que corresponde. Por ejemplo, gráfico de correlación de Ash GFP. Para ver los datos, elija una de dos opciones.

Primero, transforme los datos para que tengan un formato logarítmico seleccionando la opción matemática de proceso log auto. Luego, para reescalar visualmente los datos, haga clic en imagen ajustar brillo/contraste y seleccione auto. Segundo, reescale visualmente los datos para mostrar únicamente los valores bajos y muestre los datos utilizando una tabla de búsqueda especial o LUT para crear una LUT personalizada.

Haga clic en la edición de color de imagen LUT para una LUT muy sencilla. Haga clic en el píxel superior izquierdo y elija el color negro. Luego seleccione el siguiente píxel a la derecha y elija el color rojo.

A continuación, haga clic en el tercer píxel y, manteniendo presionado el botón del ratón, arrastre la selección hasta el píxel inferior derecho. Seleccione el color rojo, haga clic en aceptar y luego seleccione el color blanco y haga clic en aceptar. Seleccione el rango de brillo o contraste de cero a 255, como se describió anteriormente, para fijar la imagen tal como se muestra en la pantalla.

Conviértalo al formato RGB para copiar y pegar las imágenes en otros programas. Primero, abra las imágenes de ocho bits o 16 bits como se describió anteriormente. Asigne un esquema de color LUT a las imágenes para GFP.

Asigne la LUT verde haciendo clic en la imagen. Busque las tablas verdes. Finalmente, seleccione la imagen que desea copiar y cópiela al portapapeles eligiendo editar y copiar al sistema. Esta figura muestra un resultado típico para la quinasa sock fusionada, la GFP y una etiqueta TC que ha sido teñida durante 30 minutos.

Con la ash en células HEC 2 9 3, parece que ASH se une eficientemente a la proteína diana que lleva una etiqueta TC con alta afinidad. En contraste, esta figura muestra la muestra control correspondiente de SARK fusionada con GFP, pero sin la etiqueta TC, lo cual es esencial para verificar tanto la especificidad de la etiqueta TC como el nivel de tinción de fondo. Este resultado muestra que RH no tiene reactividad con la proteína diana, que carece de la etiqueta TC, lo que indica la especificidad de la etiqueta TC para la unión a SSH.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar no permitir que las células alcancen la confluencia ni se mantengan en calma, ya que esto afectará la unión de V en las células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar sus datos cuantitativamente de forma sencilla, y podrá perfeccionar estos métodos para desarrollar sus propios IUTS únicos para la visualización de datos.