Lentivirus mediada por la manipulación genética y la visualización de las neuronas sensoriales olfativas In vivo

Uno de los desafíos del estudio del desarrollo en neurociencia consiste en capturar las morfologías dendríticas y axónicas a nivel de una sola célula in vivo. En el sistema olfativo, las neuronas sensoriales olfativas extienden sus axones desde el epitelio olfativo en la nariz hasta el bulbo olfativo en el cerebro. A medida que múltiples neuronas sensoriales olfativas proyectan hacia el bulbo olfativo, se agrupan en haces.

Esto complica el estudio de las trayectorias individuales de los axones y sus morfologías terminales. Hemos desarrollado un método para visualizar neuronas sensoriales olfativas individuales in vivo mediante la microinyección de un constructo GFP portador de lentivirus.

La transducción exitosa con lentivirus ilumina toda la longitud del axón sensorial olfativo, incluyendo el arbor terminal. Además de visualizar neuronas sensoriales olfativas individuales, este método nos permite manipular la expresión génica de un gen de interés determinado para estudiar su función en un contexto in vivo. Este procedimiento con lentivirus requiere un nivel de bioseguridad dos y debe realizarse en una cabina de flujo laminar.

Para mantener un ambiente estéril, rocíe con etanol al 70 % todo lo que se introduzca en la cabina, prepare y precaliente una camilla de agua a 37 grados durante al menos 20 minutos antes de la inyección. Selle una bolsa de plástico semillena con agua y colóquela sobre un bloque calefactor vacío del incubador.

Esto permitirá que los ratones se recuperen tras la inyección. Llene un recipiente para residuos biopeligrosos con lejía al 10% para descontaminar todos los materiales expuestos al virus. A partir de este procedimiento, prepare un pequeño recipiente abierto con etanol al 70% y un segundo recipiente con agua destilada estéril.

En una cabina de flujo laminar, utilizaremos una jeringa Hamilton con una capacidad de cinco microlitros y una aguja de calibre 33. Este modelo en particular permite ajustar la resistencia del émbolo girando un dial de tensión ubicado en la parte superior de la cámara del émbolo. Esta característica proporciona control del volumen de microinyección y permite esterilizar la aguja y la cámara de la jeringa.

Aspire y expulse etanol de la placa varias veces repetidamente. Enjuague el cartucho de la jeringa aspirando y expulsando agua estéril varias veces. Coloque la jeringa de forma segura a un lado dentro de la cabina de flujo.

Coloque toallitas con alcohol cerca del puesto de inyección. Prepare una plataforma de inyección que ofrezca una superficie elevada y facilite la colocación del ratón. Puede utilizarse una placa de cultivo de 10 centímetros invertida, cubierta con toallitas Kim.

Las crías de ratón pueden anestesiarse mediante hipotermia hasta la edad de destete. Recorte un dedo de un guante de látex y coloque la cría de ratón dentro del corte del dedo. Luego, colóquelo sobre hielo durante cinco minutos.

El guante evitará quemaduras en la piel que ocurrirían por contacto directo con el hielo. Realice la prueba de anestesia completa pellizcando las patas traseras y delanteras del cachorro para asegurarse de que el animal no responda. Ahora estamos listos para la microinyección del lentivirus. Realizaremos la demostración con un cachorro neonato.

Si se utiliza un ratón de mayor edad, se debe sustituir la aguja de calibre 33 por una aguja de calibre más grueso para poder atravesar la superficie del cráneo. Esterilice la superficie nasal del ratón pasando un torunda con alcohol. Saque los stocks de lentivirus del congelador y descongele sobre hielo.

Hemos producido lentivirus en el laboratorio por nosotros mismos utilizando métodos establecidos. Al desarrollar este método, hemos encontrado que se requiere una titulación viral mínima de 10 a la novena unidades infecciosas por mililitro para obtener una buena tasa de transducción. Aspire dos microlitros de la solución stock de lentivirus hacia la jeringa esterilizada de Hamilton.

Coloque la cría de ratón encima de la plataforma de inyección. Sujete la piel de la parte superior de la cabeza a la altura de las orejas y tire suavemente hacia atrás. Hemos equipado nuestra cabina de flujo laminar con un microscopio estereoscópico.

Para dirigir con precisión las microinyecciones, busque en la superficie dorsal del cráneo en la región del prosencéfalo el contorno del bulbo olfatorio. Nuestros objetivos de microinyección rodean estrechamente el bulbo olfatorio, pero no deben incluir el propio bulbo. Realizamos cuatro inyecciones en el epitelio olfatorio de cada cría.

Estas posiciones representadas con puntos azules requieren que la aguja se inserte en un ángulo dirigido medialmente. Las dos inyecciones adicionales representadas con puntos verdes están escalonadas, más medial y anterior al bulbo olfatorio. Estas inyecciones pueden angulase ligeramente hacia abajo.

Las sugerencias sobre los ángulos de la aguja se hacen considerando la ubicación ventral del epitelio olfativo, que se sitúa principalmente debajo del bulbo olfativo. Por lo tanto, el acceso perpendicular está restringido. Inserte la aguja a través de la parte superior de la cavidad nasal aproximadamente tres milímetros por debajo de la superficie de la piel.

Para llegar al epitelio olfativo. Una mano entrenada debe percibir la disminución de la resistencia cuando se alcanza el espacio luminal de la cavidad nasal. Esta área debe evitarse.

Microinyectar 0,5 microlitros de la solución vírica por posición. Nuevamente, eligiendo dos sitios por lado, tanto izquierdo como derecho, un total de cuatro inyecciones de 0,5 microlitros. Cada uno por ratón significa que se necesitan dos microlitros de virus por ratón en una sola sesión de inyección.

Nuevamente, tenga cuidado de no inyectar el bulbo olfatorio seco ni cualquier solución viral residual o sangre que pueda escapar del sitio de inyección o de las aberturas nasales. Usando una toallita con etanol, deseche las toallitas en el recipiente con lejía diluida e inmediatamente coloque el ratón inyectado en la incubadora de cama de agua para su recuperación. Descontamine la jeringa con aguja repitiendo el procedimiento de esterilización realizado durante la preparación. Los ratones inyectados pueden regresarse a su jaula 30 minutos después de la recuperación en la incubadora de cama de agua.

Esta microinyección completa puede repetirse nuevamente en cuatro horas. Si desea aumentar el número de neuronas sensoriales olfativas que serán infectadas, las neuronas sensoriales olfativas infectadas pueden visualizarse a lo largo de toda la longitud de la célula en tan solo tres días. Los animales se sacrifican y perfunden para su observación en el momento deseado.

Utilizando métodos estándar para visualizar las trayectorias de neuronas sensoriales olfativas transducidas a nivel de célula individual y los terminales axónicos, diseccionamos y seccionamos el bulbo olfativo en cortes coronales de 60 micrones de grosor. Así, el corte contendrá todas las capas celulares del bulbo olfativo, incluyendo haces de axones de neuronas sensoriales olfativas y terminales axónicos, que forman sinapsis en estructuras glomerulares ubicadas en la superficie del bulbo, en preparación para la inmunohistoquímica en flotación. Se realizan cortes seriados del bulbo olfativo y se recogen colectivamente en una placa de cultivo de 10 centímetros con cinco mililitros de solución salina tamponada con fosfato.

Transfiera las secciones flotantes a un vial cónico de 50 mililitros. Una vez que las secciones hayan sedimentado en el fondo del vial, aspire la solución salina tamponada con fosfato. Tenga cuidado de no aspirar las secciones.

Sus secciones se reponen con 10 mililitros de tampón fresco para eliminar cualquier fijador residual o material de inclusión. Inmediatamente, aspire esta suspensión y transfiérala a un vial cónico de 15 mililitros, asegurándose de recuperar todas las secciones flotantes, retire por succión la solución de lavado y permeabilice las secciones con una solución de 0,3 % de Triton X-100 en tampón salino fosfato, colocando el vial en una plataforma agitadora durante 10 minutos. A temperatura ambiente, puede continuar entonces con un protocolo estándar de inmunotinción en el mismo vial cónico, repitiendo los pasos de succión y agitación según sea necesario para este tamaño de recipiente, manteniendo un volumen de 10 mililitros para las etapas de tinción y lavado.

A continuación se muestra una lista de los anticuerpos que utilizamos para teñir conjuntamente neuronas sensoriales olfativas positivas para la transducción y la población general de neuronas sensoriales olfativas. Para una penetración completa de los anticuerpos en cortes de bulbo de 60 micrones, se recomienda una incubación nocturna a cuatro grados Celsius. Además, cada lavado debe tener una duración mínima de 20 minutos.

Extienda suavemente cada sección sobre un portaobjetos de vidrio con un pincel y monte cada portaobjetos con FloraMount G suplementado con solución de tinción de cromatina. Haga esfuerzos por eliminar todas las burbujas del medio de montaje. Monte sus secciones en filas para facilitar el paso posterior de cribado.

Analice estas capas en sus secciones de bulbo inmunomarcadas en busca de fibras axonales y terminaciones positivas para GFP. Utilizando un microscopio fluorescente, las terminaciones nerviosas positivas pueden ser entonces observadas mediante microscopía confocal. Es útil calibrar el plano focal en su área de interés utilizando los canales de DPI y de la proteína marcadora olfativa.

Estos resultados muestran una única fibra axonal y terminal axonal de una neurona sensorial olfativa dentro del glomérulo, que es CO con la proteína marcadora olfativa en rojo y vlu dos en gris. Los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales olfativas infectadas y sus botones dendríticos también pueden visualizarse dentro del epitelio olfativo si este tejido se incluyó en los pasos de disección y inmunomarcado. Mi proyección confocal nos proporciona una morfología altamente detallada del trayecto de extensión axonal y del arbor terminal de una única neurona sensorial olfativa. Puede observarse el doblado del axón hacia su objetivo glomerular, así como los detalles de su patrón de ramificación dentro del neuropilo glomerular.

El método de microinyección de lentivirus permite la visualización de axones individuales, las morfologías de las neuronas sensoriales olfativas y posibilita estudios que manipulan la expresión génica; la transducción con lentivirus da como resultado la integración genómica estable de los constructos. El lentivirus no infecta transsinápticamente las células vecinas. La visualización puede lograrse en tan solo tres días y se ha confirmado que dura al menos tres meses, y probablemente persiste durante períodos más largos.

Los neuronas sensoriales olfativas no se infectan fácilmente mediante la infusión nasal de una solución de lentivirus. Por lo tanto, en este procedimiento es necesario realizar una microinyección a través de la superficie. Ese es nuestro procedimiento de microinyección de lentivirus.

Espero que toda esta información le haya resultado útil para lograr morfologías de células individuales. Que tenga buena suerte en su búsqueda.