Estimulación Cerebral sector mediante una red de microfluidos y de la Cámara de perfusión estándar

El principal objetivo del proyecto que vamos a mostrarles hoy consiste en poder controlar espacial y temporalmente la estimulación cerebral. Y otro punto fundamental es que, mediante una modificación sencilla en el montaje electrofisiológico ya de por sí complejo, podemos difundir este dispositivo microfluídico entre los diversos laboratorios que utilizan actualmente esta estimulación cerebral in vitro. Hola, soy Java Chek Mohammad del laboratorio de Edington en el Departamento de Bioingeniería de la Universidad de Illinois en Chicago.

Hoy voy a mostrarles cómo vamos a aplicar un dispositivo microfluídico microfabricado sencillo para la estimulación de cortes cerebrales. El dispositivo para cortes cerebrales que vamos a demostrar hoy es muy útil por varias razones, y las principales son que es tan modular que puede integrarse en el montaje electrofisiológico existente sin necesidad de modificaciones adicionales. Además, evita el uso de tubos y bombas, lo cual complica cualquier dispositivo microfluídico.

Y dado que estamos utilizando el método de bombeo pasivo, no necesitamos tubos ni bombas. Y la tercera cosa es que se trata simplemente de una lámina delgada de membrana de PDMS que se coloca entre una cubierta y una cámara de perfusión estándar, que se usa en un montaje estándar de electrofisiología. El procedimiento que voy a demostrar hoy comienza con un master C ocho, que se fabrica mediante el proceso estándar de litografía SV ocho.

Y el molde que tenemos hoy aquí es un molde de dos niveles, donde un nivel tiene el diseño de los canales, los microcanales, y otro diseño para las aberturas de vía que van encima de estos canales, de modo que las soluciones que fluyen a través de los canales puedan salir por las aberturas de vía. Así que fabricamos este molde, que está sobre una oblea de silicona, y luego utilizamos silicona o PDMS para verterlo sobre la parte superior de este dispositivo y moldear las estructuras que están sobre esta oblea en el PDMS. Por lo tanto, vamos a verter el PDMS sobre la parte superior de este dispositivo.

Luego, tomaremos la membrana de PDMS que se ha formado tras el curado y la uniremos a un cubreobjetos. De este modo, tendremos nuestro dispositivo microfluídico. A continuación, modificaremos una cámara de perfusión estándar recubriendo la parte inferior de la cámara con una capa delgada de PDMS.

Y una vez que tengamos esta cámara de perfusión modificada, tomaremos el dispositivo microfluídico que fabricamos anteriormente y lo uniremos a la cámara de perfusión. Hay dos puntos críticos en la fabricación del dispositivo microfluídico. Uno es que antes de colocar el PDMS, la placa calefactora debe estar apagada para que el PDMS no se cure instantáneamente cuando lo vertamos sobre la oblea.

Otro punto crítico es que los espaciadores que utilizamos en las cuatro esquinas de la oblea de silicio deben tener una altura menor que la estructura más alta sobre la oblea de silicio. Esto es para asegurar que se puedan obtener las aberturas de VR cuando realicemos el proceso de curado del PDMS. Aquí estamos en esta sala limpia modular de paredes blandas y este es el molde maestro que fabricamos utilizando un proceso estándar de litografía C8.

Y es un molde de dos niveles, donde el primer nivel tiene el diseño de los canales con cuatro entradas y una salida. En la región central de los cuatro canales hay orificios o pos que se sitúan encima de los canales. Estas son las marcas de alineación que se crearon durante el proceso de fabricación.

Ahora voy a mostrarles cómo voy a retirarlo y realizar la curación del PDMS. Debido al efecto de borde, el espesor en la periferia externa de la oblea es mayor que el de los dispositivos reales en el centro de la oblea. Por lo tanto, vamos a eliminar estas marcas de alineación utilizando la cuchilla reserv y, para acomodar los pesos, vamos a usar estos espaciadores de 140 micrones de altura que colocaremos en las cuatro esquinas de la oblea.

Por lo tanto, debe asegurarse de que la cuchilla de afeitar no llegue cerca de los dispositivos reales. Ahora voy a eliminar estas partículas SVA utilizando el aire comprimido y la oblea ya está lista para la preparación del molde de PDMS. Pero antes de hacer eso, necesitamos colocar estos espaciadores que tienen una altura de 140 micrones.

Así que voy a colocar las cuatro cintas en las cuatro esquinas de la oblea. Luego me aseguraré de que la cinta se adhiera correctamente a la oblea. La razón por la que la cinta tiene una altura de 140 micrones es que el molde de dos niveles, con los canales y el VS, tiene una altura de 150 micrones.

Y cuando colocamos el peso encima del PDMS durante el curado del PDMS, queremos asegurarnos de que la lámina de PDMS quede plana. Por eso estamos utilizando cuatro separadores en las esquinas con alturas iguales. Ahora voy a mostrar cómo vamos a moldear el PDMS y curarlo para fabricar los dispositivos.

Pero antes de hacer eso, permítanme mostrarles cómo preparamos la solución de PDMS. Tomamos 10 partes de la base y una parte del agente de curado, y las mezclamos completamente debido al proceso de mezcla. Observen que generamos muchas burbujas en la solución de PDMS; para eliminar estas burbujas, colocaremos el PDMS en el desecador. Después de colocar el PDMS en el desecador durante 10 minutos, no quedan burbujas.

Y ahora el PDMS está listo para ser utilizado en el curado. Ahora les mostraré cómo vamos a colocar el PDMS sobre la oblea y curarlo para obtener la membrana de PDMS. Así que voy a colocar el PDMS sobre la oblea y luego usaré esta transparencia para cubrir el PDMS.

Y esto nos ayudará a eliminar el dispositivo sup, separar el dispositivo de la transparencia, y luego voy a colocar los pesos encima de la transparencia. La razón por la que utilizamos los pesos es para obtener un espesor uniforme del PDMS. Y otro aspecto crítico es obtener las aberturas de vía.

Por lo tanto, allí donde haya vs, queremos ausencia de PDMS y los pesos nos ayudarán a lograrlo. Como se puede ver aquí, la placa calefactora está apagada y la razón de esto es que no deseamos que el PDMS se cure instantáneamente, así que la dejamos apagada. Luego, debe asegurarse de que la oblea esté plana antes de transferir el PDMS.

Y ahora podemos colocar el PDMS que preparamos anteriormente. Asegúrese de dispensar el PDMS lo suficientemente cerca de la oblea para no generar burbujas. Y el punto más crítico aquí es la forma en que coloca la transparencia encima del PDMS.

Debe asegurarse de que no se generen burbujas debido a la colocación de la lámina. Ahora voy a colocar uno de estos laboratorios de vidrio y dejar que el exceso de PDMS salga. Estoy colocando tres laboratorios de vidrio más y, para asegurarme de que los laboratorios de vidrio no se muevan, en este molde en particular.

Y para estas características particulares, descubrimos que colocar estos cuatro calzos de vidrio hace posible el VS. Y permite que el exceso de PDMS salga del camino entre la transparencia y la oblea. Esperamos de uno a dos minutos y luego podemos encender la placa calefactora. Para diferentes moldes y diferentes diseños, es posible que necesite aumentar o disminuir el número de calzos de vidrio para obtener las aberturas de los vías. Ahora la placa calefactora está lista para encenderse y voy a establecer una temperatura de 75 grados.

Y una vez que se alcanza la temperatura de 75 grados, podemos programar el temporizador durante una hora y dejar que el PDMS se cure. Ahora que hemos dejado el PDMS curándose durante una hora, podemos apagar la placa calefactora y dejar que se enfríe hasta 50 grados centígrados. La razón para hacer esto es evitar que el SEA se agriete.

Si lo retiramos inmediatamente de 75 grados a temperatura ambiente, ahora podemos apagarlo y esperar a que baje a 50 grados centígrados. Ahora que la temperatura de la placa calefactora ha bajado a 50 grados centígrados, podemos retirar los pesos de la transparencia. Ahora podemos retirar la oblea de la placa calefactora y ya está lista para cortarse.

Ahora la lámina de PDMS está lista para ser retirada del molde maestro C ocho y necesitamos eliminar el papel de aluminio. Luego debemos retirar la hoja de transparencia. Aquí tenemos la cámara de perfusión estándar.

Lo modificamos para que podamos alinearlo. Los orificios, y los puertos de entrada y salida del dispositivo microfluídico. Estos son los cuatro puertos de entrada y un puerto de salida en la membrana de PDMS.

Y estos deben coincidir con las cuatro entradas y una salida en la cámara de perfusión. Ahora voy a deslizar la cámara de perfusión y luego alinearla con los orificios en la membrana de PDMS. Ahora que están alineados, está lista para ser cortada.

Ahora puede retirar la cámara y utilizar una sonda. Asegúrese de que todos los bordes de la membrana de PDMS estén libres para ser retirados. Una vez hecho esto, podemos usar un congelador para retirar la membrana de PDMS y asegurarnos de que, al retirar el PDMS de la parte superior del dispositivo, mueva el PDMS muy lentamente para no rasgar la membrana de PDMS.

Ahora voy a colocar la membrana de PDMS con las cavidades que se formaron con los ocho moldes SC en la parte superior y asegurarme de que quede plana. La razón por la que hacemos esto es para que, cuando hagamos los orificios, los puertos de entrada y salida, el PDMS no quede rugoso en el lado que se unirá al cubreobjetos.

Por lo tanto, debemos asegurarnos de que las cavidades estén en el lado superior. Ahora podemos hacer los puertos de entrada y salida para poder ver claramente los orificios. Colocamos un fondo negro.

Ahora voy a crear los puertos de entrada y salida, y debo asegurarme de que no quede PDMS en el puerto. Por lo tanto, eliminamos cualquier resto de PDMS. Ahora vamos a transferir la membrana de PDMS a otra hoja de transparencia.

Por lo tanto, podemos tratar la lámina y la cubreobjetos con plasma y colocarla de manera que, nuevamente, las cavidades queden en la parte superior. Una vez que esta superficie y la cubreobjetos hayan sido tratadas con plasma, podemos unir ambas superficies para formar la red microfluídica y eliminar las burbujas de aire entre la lámina de PDMS. Para lograr la transparencia, se puede utilizar cinta adhesiva transparente.

Esto garantizará que la lámina de PDMS quede plana y que la unión se produzca mucho mejor. Luego, nuevamente, utilice cinta adhesiva en la superficie superior para eliminar cualquier partícula de polvo de la membrana de PDMS. Ahora podemos colocar la laminilla que uniremos con la membrana de PDMS.

Y ahora estos dos PDMS y el vidrio están listos para ser tratados con plasma. Vamos a tratar con plasma el PDMS y la cubeta mediante este sistema de plasma modificado con microondas, en el que se puede ver que la cámara de vidrio nos permite crear el plasma dentro de este microondas. Y déjeme colocar las muestras en el interior, creando vacío dentro de la cámara.

Ahora puedo hacer fluir oxígeno. Ahora el sistema de plasma está listo para funcionar y voy a utilizar una potencia del 10 % y 10 segundos para este sistema en particular, con el fin de visualizar el plasma. Mientras se realiza el tratamiento con plasma, aumentamos la potencia al cien por ciento y apagamos las luces.

Y ahora puede observarse el plasma inmediatamente después del tratamiento con plasma. Es necesario unir ambas superficies, la lámina de vidrio y el PDMS, o de lo contrario la superficie del PDMS perderá su hidrofilicidad debido al tratamiento con plasma. Una vez colocada la lámina de vidrio, asegúrese de que toda la superficie quede unida completamente sin la presencia de burbujas de aire.

Si hay burbujas de aire, puede eliminarlas. Ahora déjelo aparte durante cinco minutos y permita que se una. Aquí tenemos la cámara de perfusión modificada, en la que modificamos la base de la cámara con PDMS.

Y esto se hizo anteriormente. Así que colocamos una transparencia sobre una placa calefactora que estaba apagada. Luego vertimos el P-D-M-S-P-D-M-S que se preparó de una manera similar a la mostrada anteriormente.

Luego colocamos la cámara de perfusión encima del PDMS y colocamos un solo peso como se muestra aquí, y lo dejamos curar durante 30 minutos a 75 grados centígrados. Ahora voy a mostrar que, mientras esperamos a que ocurra la unión entre el PDMS y la cubreobjetivo, podemos proceder a preparar la cámara. Así, podemos unir la cámara y el dispositivo microfluídico.

Por lo tanto, necesitamos eliminar el exceso de PDMS de donde no lo necesitemos. Retire la transparencia y luego el PDMS. A continuación, debemos eliminar el PDMS de los puertos de entrada y salida. Ahora la cámara está lista para ser sellada con el dispositivo microfluídico que preparamos anteriormente.

Ahora que hemos esperado cinco minutos, el dispositivo microfluídico está listo para separarse de la transparencia, pero debe asegurarse de retirar la transparencia a una velocidad lenta, de modo que el PDMS y la cubreobjetos no se separen. Ahora que la cámara de perfusión está lista, necesitamos tratar con plasma la superficie inferior de la cámara donde acabamos de unir el PDMS y la superficie superior del dispositivo microfluídico que tiene el PDMS.

Ahora vamos a colocar ambas piezas en la cámara de plasma y realizar el tratamiento con plasma al 10% de potencia durante 10 segundos. Ahora ambas superficies han sido tratadas con plasma y están listas para ser unidas. Antes de unirlas, debe asegurarse de que los puertos de entrada y salida en la cámara coincidan con el dispositivo microfluídico.

Y dado que las características que estamos alineando son lo suficientemente grandes, no necesitamos ningún equipo especial y podemos hacerlo a simple vista. Una vez que alinee y coloque encima de la cámara, asegúrese de que todas las superficies estén en contacto y luego puede dejarlo reposar durante cinco minutos. De este modo, la unión será lo suficientemente buena para los experimentos tras esperar cinco minutos.

Ahora que el dispositivo microfluídico se ha unido a la cámara, vamos a hacer que los canales en la superficie del canal sean hidrofílicos. Así, cuando realmente hagamos fluir una solución de LCR o cualquier otro neurotransmisor, las soluciones podrán fluir más fácilmente. Lo que voy a hacer es colocar todo este dispositivo en el plasma y tratarlo con plasma durante un minuto al 10 %, de modo que las superficies internas completas de los canales se vuelvan hidrofílicas.

Luego lo voy a llenar con agua y después lo llevaré al montaje de electrofisiología para poder realizar los experimentos reales. Bien, ahora estamos listos para ir al montaje de electrofisiología y utilizar efectivamente este dispositivo con el trozo de cerebro. Hola, mi nombre es uo.

Estoy trabajando con la Dra. Arrington y el Dr. Fall, del Departamento de Bioingeniería de la Universidad de Illinois. Y ahora voy a trabajar con el dispositivo microfluídico que traje y acabo de colocar sobre esta plataforma. En un lado, podemos ver el tubo de perfusión.

En el otro extremo, podemos ver el tubo de succión. Así, el dispositivo se perfundirá con una solución de LCR, que se burbujea con 95 % de oxígeno y 5 % de CO₂. Ahora que el dispositivo micro V está listo, voy a obtener la muestra de cerebro y luego la colocaré sobre el dispositivo micro.

Ahora voy a colocar la sección del cerebro, eh, sobre las aberturas circulares, y luego voy a usar el anclaje para inmovilizar la sección cerebral. Ahora que la sección del cerebro está siendo inmovilizada, voy a usar eh neurotransmisores para estimularla. Aquí tenemos cuatro entradas, así que voy a introducir neurotransmisores en cada entrada utilizando el bombeo pasivo desde estas cuatro entradas hasta esta salida.

Y ahora el Dr. Fall va a hablar sobre este dispositivo. ¿Qué es tan importante para nosotros? Hola, soy Chris Fall y estudiamos la fisiología cerebral.

Y la razón por la que necesitamos utilizar cortes cerebrales es para obtener acceso con microelectrodos y tecnología de imagen. Y hasta ahora, la única manera en que podíamos modificar el entorno de neurotransmisores para estos cortes cerebrales era cambiando el flujo sobre todo el corte o aplicando neurotransmisores directamente mediante una micropipeta muy pequeña. Por eso estamos muy entusiasmados de colaborar con el Grupo de Eddington.

Esta nueva tecnología nos permitirá abordar grandes áreas del cerebro y modificar localmente el entorno de neurotransmisores. Y entonces, simultáneamente, ahora podemos intervenir con nuestros electrodos y nuestra tecnología de imagen, y quizás eventualmente integrar dispositivos de grabación multielectrodo en la misma unidad. Bien, aquí ven una sección de cerebro de ratón en el dispositivo microfluídico.

Y puede observarse incluso a simple vista que el cerebro está compuesto por muchas regiones diferentes. Estas regiones realizan funciones distintas. Y en un animal vivo, estas diferentes regiones del cerebro tendrían distintos tonos neuromoduladores y de neurotransmisores.

Y queremos poder replicar esto en nuestra cámara de cortes mientras realizamos grabaciones electrofisiológicas y de imágenes. Por lo tanto, es realmente excelente poder dirigirnos a estas diferentes áreas con distintos neurotransmisores, en diferentes concentraciones y con diferentes cursos temporales. Y aunque no podemos visualizar realmente los neurotransmisores, podemos mostrarle aquí un ejemplo de un colorante fluorescente que se está infundiendo en el corte cerebral en diferentes regiones.

Aquí se observa una película en la que se hace fluir un tinte fluorescente a través de los canales del dispositivo y simplemente se visualiza su salida por los poros que han sido creados. Incluso en este prototipo temprano, puede apreciarse lo precisa que es la resolución espacial con el flujo. Mientras observamos la película, veremos cómo el tinte fluye hacia los canales y luego sale por los orificios, y después lavaremos ese tinte, lo que da una idea de cuál es la resolución temporal del flujo.

Gracias por acompañarnos hoy. Creo que hemos podido demostrar cómo la microfluídica y, de hecho, las micro máquinas pueden combinarse con técnicas fisiológicas tradicionales para ayudarnos a comprender cómo funciona el cerebro. Gracias.