Microfabricated Post-Array-detectores (mPADs): un enfoque para aislar las fuerzas mecánicas

Hola, soy Nathan Snia Decky y hoy estoy acompañado por Wes Ligan, Robbie Desai y Mike Yang. Y somos del laboratorio de Chris Chen aquí en la Universidad de Pensilvania. En este video presentaremos nuestro enfoque para medir las fuerzas de atracción celular utilizando una matriz microfabricada de postes.

Las fuerzas de tracción se generan mediante interacciones entre miosina y actina y desempeñan un papel importante en nuestra fisiología. Durante el desarrollo, permiten que las células se desplacen de un lugar a otro para formar las estructuras tempranas de nuestros tejidos. Además, también ayudan en el proceso de cicatrización porque son necesarias para el cierre de heridas o la migración y el desplazamiento de los leucocitos a través de nuestro cuerpo.

Pero desafortunadamente, estas mismas fuerzas pueden ser perjudiciales para nuestra salud en el caso de la metástasis del cáncer o el crecimiento vascular hacia un tumor. Por lo tanto, existen muy pocos métodos con los que se puedan medir cuantitativamente estas fuerzas de tracción, especialmente a escala micro y nanométrica de células individuales. La mayoría de los métodos comunes para estudiar células in vitro han utilizado placas con fondo de vidrio o placas de poliestireno, pero estos son sustratos muy rígidos que no nos permiten medir físicamente las fuerzas de tracción ni las deformaciones que provoca una célula.

Por lo tanto, ha sido muy difícil comprender los mecanismos subyacentes de las fuerzas de tracción sin algún tipo de lectura física. Por ello, en el laboratorio de Chris Chen tenemos una técnica que nos permite superar estas limitaciones. Nuestro método se basa en un arreglo vertical de voladizos flexibles, cuya rigidez y escala de tamaño son tales que las células individuales se extienden sobre múltiples voladizos y los desvían en el proceso.

Las dimensiones que utilizamos con mayor frecuencia son cilindros de tres micrones de diámetro y diez micrones de altura, con un espaciado centro a centro de nueve micrones dispuestos en una matriz rectangular. Sin embargo, estas dimensiones pueden modificarse para adaptarse a una variedad de estudios celulares. Comenzamos con un molde maestro rígido de silicio, que puede verse aquí, y luego los trasladamos a voladizos flexibles de PDMS, como los que se observan aquí.

Utilizando esta técnica, podemos medir las deflexiones de cantilevers individuales bajo un microscopio y determinar las fuerzas de tracción celular con la magnitud y dirección necesarias para generar dichas deflexiones. Hemos convertido estos sustratos en almohadillas M para detectores de matriz de microbarras, y en este video les mostraremos cómo fabricar las almohadillas M, comenzando con el molde de silicona, pasando por la replicación en PDMS y finalmente hasta el cálculo de la modulación y la contractilidad celular. Hola, aquí estamos en la sala limpia de nuestro laboratorio.

Esta es una sala libre de polvo y sensible a la luz que nos permite fabricar los postes de SU-8 que servirán como molde de silicio. Comenzaremos con una oblea de silicio y la recubriremos con resistencia fotográfica SU-8, un resistente negativo sensible a la luz. De este modo, cuando proyectamos luz a través de esta máscara fotográfica, se genera un patrón luminoso que define los micropostes y forma una estructura tridimensional, que corresponderá a los postes de SU-8 que posteriormente replicaremos en PDMS.

Después de haber realizado todo nuestro procesamiento, la oblea tendrá este aspecto, en el que ya se han fabricado en la oblea las microcolumnas y las estructuras de micropostes. Para fabricar los moldes maestros, comenzamos primero con una oblea de silicio desnuda, que ha sido limpiada mediante un tratamiento con ozono durante siete minutos, y además hemos deshidratado esta oblea durante 30 minutos a 120 grados Celsius. Vamos a aplicar por centrifugación SU-8 2002 sobre esta oblea para formar una capa base muy delgada para los postes.

Como vamos a centrifugar SU-8, usaré una máscara de gas, recargaré la oblea en este portador aquí, eliminaré cualquier polvo que pueda haber, la colocaré en la centrífuga, verificaremos que esté centrada y luego procederemos a verter el SU-8 2002 encima. A continuación, procederemos a centrifugar la oblea. Luego colocaremos estas en la placa calefactora, el horneado suave.

Hacemos esto durante un minuto después. Luego lo tomamos y lo transferimos a la placa calefactora de 95 grados. Y hacemos esto durante dos minutos.

Y cuando termine, tomaremos esto y procederemos a realizar la exposición global en el alineador de máscaras. Bien, acabamos de centrifugar SU-8, la primera capa de SU-8 sobre este sustrato, y ahora necesitamos exponer completamente todo el sustrato para crear esa primera capa base para los micropostes. Por lo tanto, necesitamos aplicar una exposición de 70 milijulios.

Por lo tanto, necesitamos medir la intensidad real de la luz en nuestro alineador de máscaras aquí. Así que cargamos el medidor en el alineador de máscaras. Luego lo exponemos a la luz.

Esta es luz UV aquí. Cargamos la oblea de silicio en el alineador de máscaras y la colocamos dentro del alineador. Esta vez no tenemos una máscara, de modo que podemos exponer toda la película.

Coloquemos el obturador y avancemos a configurar un minuto de exposición; luego procederemos a exponer. Después de un minuto, cuando el sistema haya terminado, podemos retirar la oblea. Ahora debemos realizar la cocción posterior a la exposición.

Así que acabamos de exponer esta oblea y ahora vamos a aplicar calor para provocar la reacción de reticulación de esta primera capa de SU-8. Por lo tanto, la colocamos en una placa calefactora de 65 °C durante un minuto y luego la transferimos a una placa calefactora de 95 °C durante dos minutos. Después del proceso de dos minutos, apagamos la placa calefactora y permitimos que la oblea se enfríe nuevamente hasta la temperatura ambiente, lo cual toma aproximadamente 30 minutos.

Así que hemos depositado mediante centrifugación nuestra segunda capa de SU-8 sobre esta oblea. Y ahora necesitamos exponerla a través de la máscara fotográfica. Esta vez utilizaremos un filtro UV para bloquear la luz UV profunda.

Este es un vidrio óptico Hoya que se puede obtener, pero esta vez necesitamos volver a medir la intensidad. Por lo tanto, vamos a usar nuestro medidor de luz o vamos a utilizar el filtro superior para medir la intensidad que ha sido filtrada. Luego, cargaremos la máscara en el alineador de máscaras.

Este interruptor crea un vacío que mantiene la máscara en su lugar. Luego, la colocaremos en el alineador de máscaras. A continuación, colocaremos el filtro encima y cargaremos nuestra oblea.

Queremos asegurarnos de que haya un buen contacto, así que lo elevamos para establecer el contacto y luego comenzaremos la exposición. Después de la exposición, sacaremos nuestra oblea del alineador de máscaras. Ahora tenemos áreas que han sido expuestas selectivamente. Llevaremos esto al horno, a las placas calientes, para realizar el horneado posterior a la exposición.

Así que acabamos de realizar el PO, la cocción final tras la exposición, y ahora vamos a revelar esta oblea para obtener las estructuras tridimensionales. Lo que haremos es lavarla y revelarla en P-G-M-E-A, lo cual eliminará el SU-8 no expuesto. Primero comenzamos en un recipiente con P-G-M-E-A y colocamos la oblea aquí durante dos minutos con agitación suave.

Así que voy a dejar esto durante dos minutos. A continuación, vamos a transferirlo a un segundo recipiente con P-G-M-E-A. Esto eliminará el P-G-M-E-A saturado con SU ocho.

Después de 10 segundos lo llevaremos al IPA. Esto elimina el P-G-M-E-A. Lo colocamos aquí durante 20 segundos, nuevamente con una agitación suave.

Y entonces, en este momento tenemos las estructuras de poste independientes. Vamos a colocar esto en hexano, que tiene una baja tensión superficial. Vamos a lavar durante cinco segundos en un primer hexano y luego en un segundo, y después estaremos listos para secarlo con aire.

Así que acabamos de revelar la oblea y ahora la colocaremos sobre una placa calefactora y aumentaremos lentamente la temperatura hasta 150. Lo que ocurre es que esta temperatura más elevada provoca un mayor entrecruzamiento del SU-8, lo que lo hace más rígido estructuralmente, y lo dejamos sobre la placa calefactora durante toda la noche, entre 14 y 20 horas. Posteriormente, apagaremos la placa calefactora y permitiremos que se enfríe nuevamente hasta la temperatura ambiente.

Entonces, lo que necesitamos hacer es cortar esta oblea en un tamaño más pequeño. Básicamente queremos cortar esta oblea de silicio y crear un chip pequeño que contenga únicamente este patrón interno aquí. Y tendrá un aspecto similar a esta estructura en la que se utilizará epoxi.

Y vamos a pegar ese chip sobre un portaobjetos de vidrio así. Esto proporciona un soporte estructural. Para cortar una oblea, es algo así como un arte, pero lo que se puede hacer es utilizar básicamente un punzón de diamante y comenzar desde un solo borde.

Y debido a los planos cristalinos, simplemente haga una pequeña muesca. Ahora se ha creado una fractura, que luego puedo golpear con esta herramienta. Podemos separar esta parte y realizar más cortes aquí hasta obtener una estructura pequeña como esta. Luego, coloque rápidamente el chip de silicio sobre el vidrio y colóquelo en su lugar. Y deje que se fije.

Y así, después de terminar, tendrán un dispositivo similar a este. Hemos montado el molde de silicio sobre esta placa de vidrio y ahora vamos a aplicarle un recubrimiento de floy, que ayudará a liberar esta estructura del PDMS más adelante. Así que colocaremos el chip en este desecador y luego tomaremos unas gotas de tri Cloro Silano y colocaremos unas cuantas gotas dentro del desecador.

Hacemos esto dentro de la campana porque esto genera un subproducto de gas clorhídrico, que es bastante agresivo. Cierre la tapa, conéctela al vacío y luego dejamos que permanezca bajo vacío durante la noche para obtener un buen recubrimiento sobre toda la oblea de silicio. Hola, soy Wesley Ligan.

Soy estudiante de posgrado en el laboratorio de Christopher Chen. En este punto, Nate les ha mostrado cómo crear una matriz de silicona para nuestros sustratos ED. Sin embargo, antes de que podamos utilizar esta herramienta para medir la contractilidad celular, es necesario replicar primero las estructuras rígidas fotolitografiadas utilizando un polímero de silicona elastomérico.

Nuestra primera tarea consiste en generar una plantilla negativa del molde maestro de silicona que fabricamos previamente. Para ello, utilizamos un elastómero de silicona denominado PDMS o poli(dimetilsiloxano) para nuestro polímero de PDMS. Ahora agregamos el agente de curado en una proporción de uno a diez.

Una vez que tenemos la solución pesada, es necesario mezclar completamente el polímero de PDMS y el agente de reticulación. Esta mezcla obviamente introduce muchas burbujas de aire en nuestra solución. Por lo tanto, en este punto, es necesario destaparla y desgasificarla en un desecador al vacío.

Una vez que el PDMS esté completamente desgasificado y todas las burbujas hayan ascendido a la superficie y estallado, podemos retirarlo del desecador al vacío. Ahora podemos usar esta mezcla de PDMS y agente de entrecruzamiento para generar un molde negativo de nuestro matriz de silicio. Para hacer esto, utilizamos un molde de pastel y colocamos la matriz de silicio montada en el centro del mismo.

Luego vertemos cuidadosamente la solución polimérica de DGAs en el recipiente, sobre la superficie de la oblea de silicio, tratando de evitar la formación de burbujas adicionales. Normalmente intentamos verter el polímero con un espesor aproximado de un cuarto de pulgada. Puede observarse que este proceso introduce inevitablemente algunas burbujas de aire en la mezcla.

Ahora dejamos este recipiente aparte durante aproximadamente 30 minutos para permitir que las burbujas suban a la superficie y estallen. Podemos observar que, tras dejarlo reposar, aún quedan algunas burbujas de aire en la superficie del PDMS. Sin embargo, dado que estas se encuentran en la superficie superior, ahora podemos usar un breve pulso de nitrógeno para reventar cualquier burbuja residual.

Con el fin de reticular completamente el PDMS y la solución de CROSSLINKER y generar una plantilla negativa rígida de nuestro molde de silicio, horneamos a 110 grados Celsius durante 20 minutos. Podemos observar que hay una capa delgada de PDMS sobre el sustrato de silicona. Y antes de poder separar ambos, es necesario primero cortar y eliminar esta capa.

Luego podemos injertar esta capa superior y desprenderla suavemente del sustrato de silicio. En este punto, podemos invertir y desprender muy lentamente el sustrato de silicio negativo, el sustrato de PDMS negativo del molde de silicona. Bien, hacemos esto sosteniendo un extremo hacia abajo y desprendiendo suavemente el sustrato de PDMS.

Puede observarse el avance frontal a medida que el sustrato se separa del molde matriz de silicona. Ahora que hemos generado el molde negativo A-P-D-M-S de nuestra matriz de silicona, podemos cortar este en cuatro moldes negativos individuales para fabricar los sustratos finales de la almohadilla. En este punto, es importante no tocar la parte superior del sustrato negativo con pinzas ni con los guantes para evitar dañar la superficie.

En este momento, hemos generado cuatro moldes negativos individuales a partir del molde maestro de silicona, compuestos por pozos de tres micrómetros de diámetro y nueve micrómetros de profundidad. Para regenerar las superficies elevadas en forma de palanca, podemos volver a vaciar sobre estos moldes negativos utilizando PDMS con PDI. Sin embargo, antes de hacerlo, es necesario hacer que estos moldes negativos sean no adhesivos mediante un recubrimiento con un fluoruro.

Hacemos esto en una cámara de plasma de cien vatios a máxima potencia durante un minuto. Después de permitir que la cámara se bombee nuevamente y reanude el plasma, se genera un campo de gas iónico que graba la superficie superior del PDMS y la hace más adhesiva a las moléculas de fluoro Cy Lane. Tras retirar los moldes negativos del desecador al vacío, puede observarse aquí que lo que queda es una matriz de pozos de tres micrones por diez micrones de profundidad en una capa de PDMS no adhesiva.

Para regenerar los cantiléveres verticales, que utilizamos para los sustratos mpad, es necesario volver a moldear a partir de este utilizando nuestra misma mezcla de PDMS, lo que nos dejará con una matriz positiva de cantiléveres elastoméricos independientes, que reflejan idénticamente al molde maestro de silicio que fabricamos anteriormente. El primer paso en este procedimiento consiste en transferir nuestros moldes negativos no adhesivos a una herramienta de montaje que fabricamos con tiras de PDMS y una lámina de vidrio para microscopio. La razón de este dispositivo quedará clara en el siguiente paso.

En este punto, podemos depositar una pequeña gota de nuestra misma mezcla de 10 a 1 de PDMS con agente entrecruzante ya desgasificada sobre la superficie superior de cada uno de nuestros moldes negativos. Solo se necesita una pequeña cantidad de PDMS para que no escurra hacia el borde de los moldes negativos. En este punto.

Para extender más completamente el PDMS sobre la superficie superior de los moldes, podemos tomar uno con pinzas, invertirlo y ponerlo en contacto cuidadosamente con el molde adyacente, extendiendo el PDMS alrededor para cubrir completamente todo el sustrato. Tenga mucho cuidado en este paso para no introducir burbujas adicionales en la solución superior de PDMS. Luego, puede repetir el procedimiento con los otros dos pozos y los otros dos moldes. Ahora que tenemos un recubrimiento de PDMS más uniforme sobre la superficie superior, podemos colocar este dispositivo en un desecador al vacío para eliminar aún más cualquier burbuja que pueda estar atrapada en la película de PDMS sobre nuestros moldes negativos.

Este proceso suele tardar aproximadamente 30 minutos. Mientras nuestros moldes negativos se desgasifican, podemos limpiar los sustratos de vidrio de 22 por 22 milímetros, que serán el lugar final de montaje de las almohadillas. El primer paso en este proceso consiste en eliminar cualquier partícula de polvo mediante nitrógeno comprimido.

Expondremos las laminillas de vidrio al plasma de gas, lo que carbonizará la superficie y la hará más adhesiva al PDMS, que adheriremos en el siguiente paso. Después de dejar la capa superior de PDMS en contacto con las DGAs durante aproximadamente 30 minutos y activar las laminillas de vidrio mediante plasma de gas, podemos entonces retirar nuestra plantilla y poner en contacto la superficie superior de las laminillas de vidrio, que ha sido expuesta al plasma de gas, con la capa de PDMS situada encima de los moldes negativos. Normalmente resulta útil colocar primero un borde de la laminilla de vidrio en contacto con el PDMS y luego permitir que el resto de la laminilla se asiente en una SH, de modo que el PDMS se extienda de forma uniforme como una lámina.

Esto ayuda a reducir las burbujas que puedan haberse introducido en la película de PDMS. En este momento, podemos presionar suavemente la superficie superior del portaobjetos de vidrio con nuestras pinzas para expulsar cualquier exceso de PDMS, así como para desplazar el portaobjetos hacia la cruz de PDMS ubicada en el centro de la plantilla. Esto evitará que el portaobjetos se mueva mientras el PDMS se cura.

Repetimos esto para los otros sustratos. En este punto, podemos transferir toda la plantilla al horno y calentar a 110 grados Celsius durante 22 horas. Después de permitir que todo el conjunto se enfríe a temperatura ambiente, podemos retirar nuestros sustratos, invertirlos y desprender cuidadosamente el molde negativo del cubreobjetos de vidrio.

Es importante hacerlo lentamente y de forma uniforme para evitar aplastar los postes o arrancarlos del sustrato de vidrio. Podemos observar que, tras separar el molde negativo, queda una matriz de voladizos que replica con precisión el Modelo de Silicio, solo que ahora están construidos a partir de un elastómero flexible de PDMS. Bien, hasta este punto les hemos explicado cómo generamos el Modelo de Silicio de nuestros sustratos Emad.

Luego, hemos utilizado un proceso de moldeo por réplica para generar una réplica exacta mediante el polímero elastomérico A-P-D-M-S, de modo que los voladizos sean ahora flexibles, lo que permite a la célula extenderse, contraerse y desviar los voladizos en el proceso. En este punto, nuestros sustratos están listos para el procesamiento en cultivo celular. Ahora que hemos visto cómo fabricar y replicar moldes para hacer los eds, vamos a realizar algunos pasos más con el fin de hacer funcionales los EDS, de manera que podamos cultivar nuestras células y posteriormente analizar las fuerzas de tracción.

Pero antes de hacer eso, necesitamos realizar tres cosas. Necesitamos hacer que las puntas de los postes sean adhesivas a las células. En segundo lugar, necesitamos marcar fluorescentemente el PDMS para facilitar la visualización y el análisis de las deflexiones de los postes.

Y en tercer lugar, necesitamos hacer que las paredes laterales de los postes, así como la base de los mismos, sean no adhesivas para las células, de modo que las fuerzas de tracción se ejerzan únicamente en las puntas de los postes. Veremos cómo avanzan estos pasos mediante una estrategia basada en impresión por microcontacto en los minutos siguientes. Pero primero, el siguiente paso consiste en eliminar el exceso de P-D-S-P-D-M-S de los eds.

Como mencioné, el primer paso consiste en tomar el sustrato de EDS, que West acaba de mostrar cómo generar y recortar. El exceso de PDMS resultante de la curación de la cubreobjetivo de vidrio contra el molde negativo se recorta utilizando una cuchilla de afeitar afilada. Para eliminar el exceso de PDMS, coloque la cuchilla verticalmente sobre el sustrato en el borde de los pilares y luego raspe hacia afuera.

Y puede usar un dedo para mantener la lámina de cubrimiento en su lugar, de modo que esta no se mueva. Así, lo que se obtiene es un sustrato de pad M que ha sido limpiado de residuos y, por lo tanto, es fácilmente accesible. Para el siguiente paso, debemos imprimir por microcontacto las MPA para hacer que las puntas de los postes sean adhesivas.

Para hacer esto, primero necesitamos generar sellos, y este proceso es muy sencillo. Simplemente mezclamos PDMS en una proporción de uno a 30 en lugar de una proporción de 10 a uno. Vertemos en una placa de Petri de modo que la altura del PDMS sea aproximadamente un centímetro.

Deje que desgasifique, es decir, permita que las burbujas suban a la superficie del PDMS y luego cure la reacción de reticulación en el horno a 60 grados durante una hora. Después de retirar el recipiente del horno y dejarlo enfriar, ya estoy listo para recortar los sellos. Así que nuevamente, con el mismo tipo de cuchilla de afeitar, simplemente corte presionando verticalmente hacia abajo en el PDMS hasta que haga contacto con la base de la placa de Petri.

Ahora, la orientación del sello es algo a lo que queremos prestar atención. La superficie del sello será el lado del PDMS que se moldeó contra el fondo de la placa de Petri para que permanezca plana. Entonces, en este cuadrado grande de PDMS que he recortado, la superficie del sello ahora está hacia arriba.

Ahora esta estampa es mucho más grande que las almohadillas M, así que voy a recortarla hasta el tamaño de una sola almohadilla M nuevamente, cortando con la cuchilla de afeitar. Como es muy difícil determinar la orientación correcta de la estampa a simple vista, voy a hacer una pequeña muesca en lo que será el reverso de la estampa, es decir, el lado no frontal, así. Luego puedo retirar la estampa del bloque más grande. Y ahora tengo una estampa A-P-D-M-S para el siguiente paso.

Queremos limpiar los sellos de PDMS, ya que es muy probable que se haya depositado polvo atmosférico sobre ellos durante el corte. Este es un proceso en el que colocamos el número deseado de sellos de PDMS en este vaso de cristalización y llenamos el vaso con etanol al 100 %.

Añada suficiente etanol para cubrir la superficie de los sellos, aunque la cantidad exacta de etanol añadido no es importante. Luego, coloque el disco de cristalización en un agitador y someta los sellos a sonicación durante cinco minutos. Una vez transcurridos los cinco minutos, finalice la esterilización de los sellos y realice el resto de la impresión por microcontacto, es decir, la funcionalización de las almohadillas M, en una cabina de cultivo celular estéril.

Ahora estamos en la campana de cultivo celular donde podemos finalizar la esterilización de los sellos. Para ello, tomamos los sellos del recipiente de cristalización, los sumergimos en un recipiente lleno de etanol para eliminar cualquier residuo restante y, finalmente, los sumergimos en un recipiente con agua para eliminar el etanol. Luego, con un chorro de nitrógeno, secamos los sellos hasta que ya no queden gotas visibles.

Entonces, el siguiente paso consiste en entintar los sellos con una solución de proteína. La solución de proteína que estamos utilizando es de 50 microgramos por mililitro de fibrina en agua DEI. Simplemente aspire un poco de la solución de proteína con la pipeta y coloque gotas de la solución sobre la superficie del sello.

Usted desea hacer esto colocando pequeñas gotas en el borde de la cara del sello. Primero, repita esto para todos los sellos que vaya a utilizar y yo debería haber hecho esto por adelantado. Así que el siguiente paso, después de haber colocado puntos en los bordes de todos los sellos, es conectar esas gotas y llenar la cara del sello con la solución de proteína.

La razón por la que hicimos esto es porque la solución de proteína en las gotas y así sucesivamente debajo de las gotas hace que la superficie del sello sea hidrofílica, lo que facilita la distribución de la proteína de la matriz extracelular. Así que nuevamente, repita este procedimiento para todos los sellos que esté utilizando. Ahora que hemos distribuido la solución de proteína sobre la cara de los sellos, el último paso en la tinta de los sellos es asegurarse de que los bordes estén cubiertos. Para hacer esto, simplemente inclinamos una pipeta y la deslizamos a lo largo de la cara del sello de manera que haga contacto tanto con la esquina del sello de PDMS como con la solución de proteína.

Y nuevamente, repita esto para todos los bordes de todos los sellos que esté entintando. Ahora que hemos terminado de entintar los sellos, colóquelos y déjelos en la cabina de cultivo celular durante una hora para facilitar la absorción completa de la proteína en la superficie del sello. Después de esperar una hora para que las proteínas se adsorban completamente en la superficie del sello, ahora es momento de enjuagarlos con agua y secarlos con nitrógeno.

Para hacer esto, tomamos agua estéril y vertemos el agua estéril en el recipiente que contiene los sellos. Tenga cuidado de no verter el agua directamente sobre la superficie del sello y puede usar una pipeta si es necesario. La cantidad exacta de agua que tenga no es importante, siempre que eleve el nivel del agua por encima de la solución proteica.

Después de esto, con pinzas estériles, tome un sello, sumérjalo en un nuevo recipiente con agua y séquelo suavemente con nitrógeno. Nuevamente, sabrá que está seco cuando ya no vea gotas de la solución proteica en el sello. Repita este procedimiento para todos los sellos que esté procesando, uno a la vez.

Ahora que hemos enjuagado las matrices hasta secarlas, es momento de activar los sustratos de mpad tratándolos con ozono UV. Durante siete minutos, retiro la tapa de la placa de Petri, desde la parte superior del recipiente. Debido a que el poliestireno absorbe el UV, coloco entonces la placa en el tratador de ozono UV, cierro el cajón, fijo el tiempo en siete minutos y comienzo el proceso.

Ahora estamos de regreso en la cabina de cultivo celular y es momento de estampar los sustratos mpad, que acaban de ser tratados con ozono UV. Para ello, levante los sellos enjuagados y secos con pinzas. Puede manipular los sellos por los lados, pero no toque la superficie del sello.

Desea ajustar el sello en la pinza de modo que el lado de la proteína quede accesible. Luego invierta la pinza, teniendo en cuenta que el lado de la proteína queda hacia abajo, y acerque lentamente el sello al eds. Los sellos del uno al 30 son bastante adhesivos, por lo que puede ser necesario usar un segundo par de pinzas para liberar el sello de la pinza.

Puede soltar el sello desde una altura de aproximadamente dos milímetros hasta unos ocho milímetros sobre los emeds. Luego, incline el recipiente de los emeds hacia arriba y presione suavemente con pinzas para crear contacto entre el sello y los eds. Sabrá que se ha establecido contacto de una de dos maneras.

La primera consiste en observar la superficie del DE a través del lateral del sello. Esto puede ser difícil de ver en cámara, pero a simple vista puedo ver claramente que el sello está haciendo contacto con la superficie al mirar la superficie a través del lateral del sello. La segunda forma de asegurar el contacto es, con la p, sacar la placa de Petri de la cabina de cultivo celular con la tapa puesta y observarla bajo un microscopio invertido.

Al visualizar los patrones de interferencia con el microscopio, debería poder determinar cuándo, si es que ocurre, el sello está en contacto con los eds. Una vez que haya determinado el contacto, el sello solo necesita permanecer en contacto con este, con el sustrato ed, durante unos pocos segundos. Por lo tanto, es momento de retirar el sello.

Para hacer esto, doble los Eds hacia abajo con un par de pinzas y, en un solo movimiento suave, retire el sello. Asegúrese de llevar un registro de qué eds ha sellado y qué sellos ya ha utilizado previamente. Repita este procedimiento una vez por cada EMPA para cada sustrato que desee utilizar.

Ahora que hemos estampado las EMPA, el siguiente paso es esterilizarlas y luego incubarlas en un colorante lipofílico denominado dye eye. Dai es una molécula lipofílica marcada con fluorescencia, de modo que se difunde en el PDMS durante un tiempo determinado, lo que nos permite visualizar las deflexiones de los postes bajo el microscopio. Lo que voy a hacer es tomar cada sustrato individual de empa, uno por uno, e inmersarlo en etanol al 100 %, etanol al 70 %, agua DI, agua DI, agua DI, agua DI.

Y finalmente, una solución de cinco microgramos por mililitro de dii. La solución de DII es fluorescente, por lo que para minimizar su exposición a la luz ambiental y reducir el blanqueo fotográfico, cubrimos las placas con papel de aluminio mientras incuban en la cabina de cultivo celular durante una hora. Ahora que hemos esperado una hora para que las almohadillas EM incuben en la solución de DAI, podemos retirar el papel de aluminio y enjuagar la solución de DAI.

Enjuagamos eliminando mediante tres inmersiones secuenciales en agua esterilizada y, finalmente, sumergimos en una solución de F1 27 al 0,2 %. Es decir, 0,2 % peso por volumen. Durante todos los pasos de inmersión, es importante minimizar el tiempo que los almohadillas de EM están expuestos al aire. Esto se hace para prevenir daños en los sustratos de ED y, específicamente, para evitar que dos postes colapsen uno sobre el otro.

El F1 27 al 0,2 % es un copolímero tri-bloque compuesto por dominios hidrófilos e hidrófobos. Se sabe que el dominio hidrófilo resiste la absorción de proteínas y, por lo tanto, la adhesión celular, mientras que el dominio hidrófobo se une al PDMS hidrófobo. Así, cuando el PDMS se sumerge en F1 27, el F1 27 se une al PDMS y repele la adhesión celular.

Después de una hora de incubación en F1 27 crónico en una placa de Petri cubierta con papel de aluminio, podemos eliminar el F1 27 mediante inmersiones sucesivas en agua estéril, agua estéril y PBS. Después de la inmersión en PBS y una vez que se ha eliminado completamente el producto F1 27, podemos sumergir entonces los sustratos eds en la solución de cultivo celular elegida. La solución de cultivo celular en la que acabo de sumergir las EMPAs puede contener suero y/u otros factores de crecimiento y/o suplementos como penicilina y estreptomicina.

Todos estos ingredientes son completamente compatibles con los tratamientos EMPA. Ahora, el siguiente paso, una vez que los eds hayan sido sumergidos en la solución de cultivo celular, es sembrar las células de elección sobre los eds. Para este montaje experimental en particular, sembraré células endoteliales aórticas pulmonares bovinas en tres placas diferentes.

La razón por la que estoy utilizando tres platos diferentes es porque trataré dos de los platos con inhibidores de tactilidad conocidos para inhibir las deflexiones de los postes, tal como podremos evaluar en un momento posterior. Para sembrar las células, simplemente tomo mi suspensión celular, aspiro la cantidad adecuada en la pipeta y la agrego gota a gota en cada plato. Añado suficientes células para que, cuando realice el ensayo para medir las fuerzas de tracción, las células existan como células individuales sobre los eds.

La cantidad que agregue dependerá del área de distribución, así como de la tasa de crecimiento de sus células particulares. Por lo general, sembramos entre 1500 y 5000 células por centímetro cuadrado de sustrato. Después de terminar de sembrar las células o de modificar la suspensión celular, agregue gota a gota la suspensión a la placa y mueva suavemente la placa de cultivo varias veces hacia adelante y hacia atrás en direcciones ortogonales para mezclar la suspensión celular en la placa de cultivo.

Repita este proceso para todos los sustratos que esté utilizando. Inmediatamente después de sembrar las células, colóquelas en un incubador a 37 grados a un nivel adecuado de dióxido de carbono para tamponar el pH y el medio de cultivo celular. Aproximadamente dos horas después de sembrar las células, es apropiado lavarlas transfiriendo los sustratos de un recipiente con medio a un recipiente nuevo con el mismo medio de cultivo celular.

La razón de este lavado es que la mayoría de las células habrán comenzado a expandirse y habrán alcanzado casi su área final de expansión en dos horas. Al lavar las células, los sustratos, se eliminan las células flotantes del medio de cultivo celular. De este modo, solo las células que se han adherido al EDS y que están iniciando el proceso de expansión serán visibles en el ensayo final de fuerzas de tracción.

Un ensayo que podemos realizar con células cultivadas en MPAs es la imagen de lapso de tiempo para examinar cuantitativamente la dinámica de la contractilidad celular. En particular, resulta interesante la dinámica de la contractilidad celular en respuesta a factores solubles. Se sabe que factores solubles, como compuestos biológicos y compuestos sintéticos, aumentan, disminuyen o tienen efectos desconocidos sobre la contractilidad celular.

Para este experimento con células vivas, utilizaremos este microscopio invertido de epifluorescencia. Sobre la platina del microscopio, hay una caja de incubadora pequeña conectada a un regulador térmico para mantener la temperatura a 37 grados Celsius con 5%CO2. Realizaremos imágenes con alta magnificación utilizando un objetivo plan APO de 60x.

Ahora prepararemos el sustrato de impacto para la obtención de imágenes. El objetivo de 60x que estamos utilizando para la obtención de imágenes tiene una distancia de trabajo de 200 micrones, que es mucho más delgada que el grosor del recipiente de cultivo de tejidos en el que sembramos las células anteriormente. Por lo tanto, no podemos, no podemos obtener imágenes de las células sobre los implantes en el recipiente de cultivo de tejidos.

Para solucionar este problema, utilizamos estas placas con fondo de vidrio. Ahora transferiré el sustrato a la placa con fondo de vidrio boca abajo, de modo que las células y las puntas de los postes queden en la interfaz del fondo de vidrio. Por lo tanto, cuando esto se coloque en el microscopio, la distancia de trabajo entre las células y el objetivo será menor a 200 micrones.

Ahora estamos listos para colocar esto en un microscopio para la obtención de imágenes. Ahora abriré la cámara de incubación para células vivas, colocaré la muestra en el interior y volveré a colocar la tapa de la cámara de incubación. En este momento, escanearé el sustrato en busca de una célula adecuada.

Para realizar la imagen. La forma más eficiente de hacerlo es utilizar un objetivo de 10x con fase de contraste, lo que me permitirá observar un campo más amplio del sustrato y encontrar una célula más rápidamente. Mi criterio para una buena célula es que sea una célula individual.

No debe estar tocando ninguna célula vecina, y además debe tener un tamaño aproximadamente promedio en comparación con todas las demás células sobre el sustrato; he encontrado una célula adecuada para observar. Lo siguiente que haré es cambiar el objetivo a 60x para observar la célula con alta magnificación. Para ello, desenfocamos el objetivo, de modo que no golpee la platina durante la rotación.

Al girar la torreta, abra la cámara, gire parcialmente el objetivo de 60 x para alinear el objetivo de 60 x; el objetivo de 60 x es una lente de inmersión en aceite, por lo que debemos colocar una gota de aceite de inmersión sobre el objetivo. Ahora terminaremos de girar la torreta para colocar el objetivo de 60 x en posición. Cerraremos la cámara de incubación y volveremos a enfocar el objetivo para que la célula quede nuevamente enfocada.

Una vez que ajuste con precisión la posición y el enfoque de la célula, cambiaré a la cámara CCD para previsualizar la célula en la pantalla del ordenador y luego comenzaré la adquisición de imágenes con lapse de tiempo. Para este experimento, recopilaré tanto imágenes de contraste de fase como imágenes fluorescentes a intervalos de un minuto; así que ya se ha iniciado la adquisición de imágenes con lapse de tiempo y la dejaré correr durante 10 minutos o 10 cuadros, y en ese momento añadiré suero. Ya han transcurrido 10 minutos. En este momento, abriré la cámara y añadiré suero al cultivo para estimular la contractilidad en la célula.

El temporizador aún está en marcha, así que debo hacer esto rápidamente. Ahora, continuaremos obteniendo imágenes de la célula durante 30 minutos para seguir cualquier cambio en la contractilidad. Después de finalizar la adquisición de imágenes con lapso de tiempo, las imágenes pueden ensamblarse en una película que se mostrará. A continuación se presentan dos películas de las imágenes de contraste de fase y de fluorescencia.

A la izquierda hay una película de fase de una célula mayormente transparente delimitada en negro. La célula se extiende sobre las puntas de 20 postes, que son estructuras circulares dispuestas en una red rectangular. A la derecha hay una película fluorescente de la misma célula, pero solo son visibles los postes.

Si reproduzco estas películas, verá que los postes unidos a la célula inicialmente son débiles, ligeramente desviados y se apartan muy poco de la red rectangular. Hacia la mitad de la película, agregué suero al medio. El suero estimula a la célula para que aumente su contractilidad.

A medida que la célula ejerce mayores fuerzas de tracción sobre los postes subyacentes, los postes a lo largo del perímetro de la célula comienzan a desviarse hacia adentro. En la película fluorescente, ahora se observa que los postes se desvían significativamente de sus posiciones en la red rectangular. Como describiré más adelante, el desplazamiento de estas posiciones de los postes en estas imágenes puede utilizarse para analizar las fuerzas de tracción de esta célula.

Anteriormente, vimos cómo generamos los sustratos mpad y cómo los funcionalizamos para cultivar células. Ahora habrá notado que coloqué los sustratos mpad terminados en tres placas de cultivo celular diferentes. Las células han estado creciendo durante la noche, y ahora lo que voy a hacer es tratar cada placa de cultivo celular individual con un agente soluble diferente que modular la contractilidad de una manera conocida.

Luego podemos medir de manera cuantitativa las fuerzas de tracción que resultan después de fijar las células durante 30 minutos. Después de agregar los factores solubles 30 minutos tras la adición de los inhibidores de la contractilidad, es momento de fijar las células con paraformaldehído para bloquear el estado actual de las fuerzas de tracción. Para ello, es importante utilizar paraformaldehído que contenga calcio y magnesio, y usamos paraformaldehído en un porcentaje volumétrico del 3,7 %. El método para sumergir los sustratos en paraformaldehído, perdón, es el mismo que el método para sumergir los sustratos en este, en las diferentes RINs durante la funcionalización.

Es decir, es importante no dejar que los sustratos se sequen, ya que esto podría provocar el colapso posterior. Después de transferir los sustratos, los dejo incubar en paraformaldehído durante 20 minutos. Una vez transcurridos los 20 minutos, retiramos los sustratos del paraformaldehído; ahora que las células han sido fijadas, podemos procesar estas muestras para una inmunotinción estándar.

Para ello, colocamos los sustratos boca arriba sobre param y agregamos con pipeta suficiente PBS para cubrir el sustrato y mantenerlo sumergido bajo el PBS. Luego, enjuagamos el sustrato tres veces con PBS para eliminar cualquier paraformaldehído que pueda haber quedado en el cultivo. Después de enjuagar el sustrato tres veces con PBS, podemos transferirlo para la inmunotinción posterior.

Hacemos esto manipulando el sustrato con un par de pinzas e invirtiéndolo en el primer paso de la inmunotinción, que consiste en un agente de permeabilización. En este caso, estamos utilizando Triton X al 0,2 % en PBS. Sin embargo, el usuario puede utilizar cualquier agente de permeabilización que sea más adecuado para sus necesidades.

Repetimos esto para todos nuestros sustratos y así es como manipulamos los sustratos durante el proceso de tinción inmunológica. Tras la tinción inmunológica, los sustratos se montan sobre una portaobjetos de vidrio estándar de una pulgada por tres pulgadas, que luego puede procesarse en cualquier microscopio de fluorescencia epiluminiscente, ya sea invertido o vertical. Al procesar las muestras en un microscopio confocal, podemos enfocar la base de los postes para obtener las posiciones no desviadas, es decir, las posiciones nulas.

Luego podemos enfocar hasta las puntas de los postes, tomar otra imagen de los postes y, comparando la imagen superior con la inferior, podemos medir las deflexiones de los postes y calcular las fuerzas de tracción de las células que generaron dichas deflexiones. Al realizar este proceso para muchas células diferentes bajo varias condiciones distintas, podemos comparar las fuerzas de tracción generadas en las diferentes condiciones. Ahora que hemos recolectado imágenes de células vivas y fijadas, nuestra siguiente tarea consiste en medir la deflexión, así como las fuerzas de tracción en las células.

Para hacer esto, hemos escrito un programa informático en matlab. Estas son las tres imágenes que utilizaremos en este análisis. La primera imagen es una imagen de fase de la célula.

Es útil para identificar la ubicación de la célula. La segunda imagen es una imagen fluorescente de las partes superiores de los postes. Utilizamos esta imagen para localizar las posiciones de los, de los postes en sus extremos.

Como puede observarse, algunos de estos postes se desvían y desvían de la red rectangular en la que se encuentran la mayoría de los postes, como este poste. Y este poste. La tercera imagen que utilizaremos es la imagen base, que captura la posición de los postes en un plano focal que atraviesa la base de estos.

En este nivel, tanto los postes desviados como los no desviados deben estar ubicados en su posición de reposo, es decir, en sus posiciones sin desviación. En la red rectangular, puede observarse que los postes que se desviaron en la segunda imagen en su base se encuentran en su posición FL. Esta imagen se utiliza para hallar la posición del poste, su posición bajo reflexión.

A continuación, cargamos el programa MATLAB, que nos pedirá cargar estas tres imágenes. Asigne un nombre al archivo. Aquí se muestra la imagen de fase.

Dibujaremos un cuadro alrededor del área que indica dónde se encuentra la célula, para que el programa sepa qué postes analizar. Luego, el programa realiza la intensidad, umbralización y ización de la imagen recortada para determinar las coordenadas OID de los postes. A la izquierda se muestran imágenes izadas de los postes provenientes de la imagen superior, mientras que a la derecha hay imágenes izadas de los mismos postes provenientes de la imagen de base.

Tras obtener los postes y las coordenadas OID, el programa puede entonces determinar los vectores de desplazamiento entre la punta y la base de cada poste. Estos vectores de desplazamiento de los postes pueden convertirse en vectores de fuerza multiplicándolos por la constante elástica del poste. Podemos analizar estas fuerzas celulares de varias maneras, como la fuerza promedio por célula o la fuerza promedio por poste.

Un resultado útil es un gráfico de vectores en el que podemos visualizar la distribución espacial de las fuerzas. Esta es la célula que acabamos de analizar y puede observarse que he superpuesto flechas amarillas sobre los postes, las cuales se correlacionan con la magnitud de la fuerza y apuntan en la dirección de la misma. Al repetir este proceso de análisis de imágenes para secuencias de imágenes, como las necesarias en nuestra película de lapsos de tiempo, podemos generar una secuencia temporal.

Aquí hay una película de la célula que estimulamos con suero. Como puede observarse, justo cuando se añadió el suero, la célula incrementó su contractilidad y desvió aún más los postes. Además, podemos cuantificar las fuerzas en un mayor número de células que han sido sometidas a diferentes condiciones y luego fijadas y teñidas, como lo ejemplifican estos gráficos de flechas que muestran una célula tratada con un compuesto control frente a células tratadas con inhibidores de la contractilidad.

Como puede observarse, los vectores de fuerza sobre la célula en el caso de control son mayores en longitud y magnitud que los vectores de fuerza en los dos casos en los que se utilizaron inhibidores de la contractilidad. Hemos cubierto una gran cantidad de material aquí para describir la vía del sustrato, desde la microfabricación hasta la preparación de muestras, experimentación y análisis, con el fin de demostrar la versatilidad de estos sustratos.

Hemos descrito dos ensayos diferentes: imágenes de células vivas y ensayo con muestras fijadas, y hemos realizado el análisis de células obtenidas a partir de ambos ensayos, mostrando gráficos de vectores y películas de vectores. Con esta herramienta poderosa, se puede realizar una variedad de análisis espaciales y temporales de la contractilidad celular. Como vieron, este método integra diversas disciplinas, incluyendo la microfabricación, la biología celular básica, la ciencia de superficies, el análisis y procesamiento de imágenes, y muchas otras.

Y es precisamente porque su método se basa en varias técnicas de ingeniería diferentes que los parámetros, como la geometría del poste, los factores solubles inducidos y los métodos para analizar las deflexiones del poste, pueden personalizarse según las necesidades del usuario. Esperamos que la demostración visual de este método que describimos en los últimos 20, 30 minutos pueda utilizarse como punto de partida para otros análisis, más profundos, sobre la regulación, las consecuencias funcionales y la generación de fuerzas de atracción celular.