El uso de una trampa óptica para el estudio de interacciones huésped-patógeno de imágenes dinámicas de células vivas

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar el atrapamiento óptico combinado con microscopía confocal de disco giratorio para observar en tiempo real las interacciones entre el huésped y el patógeno. Esto se logra primero añadiendo los patógenos de interés a un portaobjetos con cámara. A continuación, se selecciona y captura una partícula con la trampa óptica.

Finalmente, la partícula se dirige hacia la célula de interés. Como se observa aquí. El atrapamiento óptico puede ser un método eficaz para controlar dos partículas durante la observación de interacciones intracelulares dinámicas.

Este método puede responder preguntas importantes sobre las interacciones entre hospedador y patógeno en los campos de enfermedades infecciosas e inmunología, como cuál es el efecto sobre la fagocitosis cuando se logra un control completo de las relaciones espaciales entre las células del hospedador y los patógenos, así como si el orden en que los patógenos son internalizados por una célula fagocítica afecta la maduración fagosomal. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las condiciones de atrapamiento deben optimizarse para diferentes tipos de células y de microesferas. La demostración visual de este método es fundamental, al igual que el proceso para configurar e integrar un disco giratorio.

El confocal con una trampa óptica es difícil de conceptualizar debido al alineamiento preciso que es necesario para todos los componentes ópticos. Recolecte el patógeno de interés. Por ejemplo, aquí, se retiran 300 microlitros de Candida albicans cultivados durante la noche en caldo de la cultura y se transfieren los patógenos a un tubo de reacción de 1,5 mililitros.

Luego, lave los patógenos tres veces a aproximadamente 1300 Gs durante cinco minutos a temperatura ambiente, aspirando el sobrenadante y dejando el precipitado intacto cada vez en PBS resuspendido y sonicado. Después del tercer lavado, resuspenda el precipitado en 500 microlitros de PBS. A continuación, disuelva un miligramo del colorante de confianza en 100 microlitros de dimetilformamida para obtener una concentración final de 10 miligramos por mililitro.

Luego, agregue tres microlitros de la mezcla de colorante al tubo de reacción que contiene los patógenos lavados. Envuelva los tubos con papel de aluminio, ya que los colorantes son sensibles a la luz, y agite la muestra a 37 grados Celsius durante una hora; luego, centrifugue y lave la muestra en PBS tres veces como antes. Re suspenda el botón celular en 300 microlitros de PBS tras el último lavado.

Caliente el medio y el PVS a 37 grados Celsius en un baño de agua. Lave una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros recubierta con macrófagos RAW 264.7 dos veces con PBS, aspirando el PBS entre cada lavado. A continuación, cubra la superficie de la placa con cinco mililitros de tripsina e incube la placa durante cinco minutos a 37 grados Celsius.

Luego, golpee suavemente el lateral de la placa para desprender las células de la superficie. Tenga cuidado de no salpicar la tripsina fuera de la placa. Ahora agregue cinco mililitros de medio a la placa y transfiera la mezcla a un tubo de reacción.

Después de la centrifugación, aspire el medio de las células teniendo cuidado de no perturbar el sedimento y resuspenda el sedimento en 10 mililitros de medio. Añada 400 microlitros de medio a cada cámara de una cámara portaobjeto, y luego añada cinco microlitros de la suspensión celular a cada cámara. Deje crecer las células durante la noche en un incubador a 37 grados Celsius con 5%CO2.

Retire el portaobjetos con cámaras del incubador y agregue entre cinco y diez microlitros de los patógenos marcados con fluorescencia previamente preparados en cada cámara que contenga macrófagos. Mezcle cuidadosamente los macrófagos y los patógenos mediante pipeteo ascendente y descendente, teniendo cuidado de no tocar el fondo de la cámara y alterar los macrófagos adheridos. Encienda todos los componentes del microscopio confocal de disco giratorio.

Prepare el microscopio añadiendo aceite a la lente de inmersión. Inserte la cámara portaobjetos en la platina especializada y luego retire la tapa de la cámara portaobjetos; alinee el microscopio para la imagen en contraste de interferencia diferencial (DIC). Encienda el obturador de la trampa óptica y el láser de infrarrojo (IR).

Luego abra el obturador del láser hacia la trampa óptica. Confirme que el obturador frente al láser de infrarrojos esté cerrado mediante la verificación con la tarjeta de infrarrojos. Ahora enfoque los macrófagos en el portaobjetos adherido.

Luego, encuentre los patógenos que flotan libremente en la solución adyacente a los macrófagos. La parte más difícil de este procedimiento consiste en encontrar el objeto adecuado para rastrear en la cámara de muestra debido a las fuerzas de adhesión entre el objeto y el cubreobjetos en la cámara de muestra. Para mover ese objeto, debe mover la platina mientras el objeto es sostenido por el láser de trampa, y también es importante tener en cuenta que debe mover la platina a una velocidad suficientemente lenta de modo que la fuerza de arrastre de la platina no supere la fuerza máxima de trampa generada por la trampa.

Mueva la platina de manera que el patógeno quede cerca de la trampa. Luego abra el obturador y active la trampa. Mueva la muestra para poner los macrófagos en contacto con una imagen del patógeno atrapado y estacionario.

Los patógenos con un microscopio confocal de disco giratorio, ya sea en contraste de interferencia diferencial (DIC), en fluorescencia o en una combinación de ambos, mostraron poblaciones separadas de Candida albicans, que normalmente tienen un tamaño de aproximadamente cinco micrones, teñidas de verde, azul y rojo. Para ilustrar la adquisición de imágenes, se atrapó un solo C. albicans y se movió en un patrón cuadrado a través de un grupo de otras levaduras, como indican las flechas grises, lo que demuestra la capacidad de capturar y manipular la ubicación específica de un único patógeno seleccionado por el operador, incluso en un entorno congestionado. Para ilustrar aún más la flexibilidad de este sistema para atrapar las diferentes morfologías de forma que presentan los organismos patógenos en esta figura, se utilizó la pinza óptica para sostener y posicionar una partícula de C. albicans con una seudohifa.

La C albicans se marca con un colorante rojo y se mueve a lo largo de una trayectoria indicada por la flecha blanca, colocándose junto a células crudas GFPL C3 fluorescentes. En verde. La porción de levadura de la albicans quedó atrapada mientras los seudohifas se extendían.

Aspergillus fum goddess también se posicionó junto a una célula de macrófago de ratón en estado natural para analizar el marco temporal absoluto de la fagocitosis con esta línea celular y patógeno específicos. En esta figura, las imágenes de campo brillante muestran cómo el Aspergillus atrapado, indicado por la flecha blanca, fue movido y posicionado a lo largo del recorrido indicado por la flecha roja. El patógeno atrapado está ligeramente fuera de foco debido a que la trampa empuja ligeramente al organismo por encima del plano focal.

Aspergillus se movió hasta colocarlo adyacente a la célula bruta deseada. Una vez que el patógeno entró en contacto con la célula, se desactivó la trampa. Se activó el proceso de fagocitosis y se utilizó imágenes de lapso de tiempo para observar los eventos celulares subsecuentes.

A los 30 segundos, la membrana de la célula cruda comenzó a cambiar y a formar una copa alrededor de la partícula. A los 60 segundos, la copa estaba completamente formada. De los 90 a los 150 segundos, el Afu Gotti fue envuelto y englobado, y a los 180 segundos la partícula fue completamente internalizada.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo crear un aparato de trampa óptica con disco giratorio y cómo dicho instrumento puede permitir controlar de manera no invasiva patógenos para la obtención de imágenes de células vivas tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las interacciones huésped-patógeno estudiaran el papel de las relaciones espaciales entre las células huésped y los patógenos, y su influencia en la respuesta inmunitaria subsiguiente.