Utilización del modelo de EpiAirway para la caracterización de largo plazo Interacciones Huésped-Patógeno

El objetivo general del siguiente experimento consiste en realizar un cultivo conjunto a largo plazo de Hemófilo influenzae no tipificable o NTHI con tejidos epiteliales respiratorios humanos primarios utilizando el modelo epi airway. Esto se logra inoculando la superficie apical con NTHI para permitir que las bacterias se adhieran y penetren en los tejidos como segundo paso. Los insertos se lavan cada 24 horas con DPBS precalentado para imitar el flujo normal del moco y eliminar productos de desecho de la mucina y cualquier resto celular.

A continuación, los tejidos se recolectan en el punto de tiempo deseado y se determina la supervivencia de NTHI asociado a células totales o internalizado. Finalmente, mediante este método, pueden evaluarse las características específicas de la cepa respecto a la supervivencia de NTHI en los tejidos a lo largo del tiempo, basándose en recuentos de bacterias viables. Aunque este método puede proporcionar información sobre infecciones de larga duración con hemófilo influenza no tipificable.

También puede utilizarse en el estudio de otros patógenos humanos, como Moraxella Alis. Quien demostrará este procedimiento será la Dra. Doin ran, investigadora posdoctoral en mi laboratorio. Retire la placa de transporte de su envase y prepárese para comenzar el experimento. Rocíe la placa de transporte con etanol al 70 % y coloque la placa en la cabina de seguridad biológica.

Aliquotar un mililitro de medio de mantenimiento para vías respiratorias epi a cuatro grados Celsius en cada pocillo de una placa de seis pocillos. Luego, después de retirar la cinta, abrir la placa y eliminar la gasa que cubre los insertos de vías respiratorias epi. Usando un movimiento de giro, utilizar pinzas para liberar un inserto de los aros.

Coloque el inserto en uno de los pocillos de la placa de seis pocillos si es necesario. Utilice un hisopo estéril para retirar cuidadosamente los aros del inserto, evitando tocar la membrana. Confirme que no queden burbujas de aire atrapadas debajo de los insertos.

Luego, coloque la placa de seis pocillos en un incubador. Lave los insertos diariamente de la siguiente manera: caliente previamente DPBS con calcio y magnesio, y llene una punta con el DPBS. A continuación, utilizando fórceps estériles, tome suavemente un inserto y agregue 200 microlitros del DPBS precalentado sobre el tejido.

Luego, agite suavemente el inserto para distribuir uniformemente el DPBS sin tocar el tejido. A continuación, incline el inserto en un ángulo y coloque la punta de una pipeta P1000 contra el anillo de plástico que sostiene la membrana en la parte inferior del inserto. Después, aspire cuidadosamente la solución tampón y coloque la solución en un tubo criogénico para su posterior estudio.

Finalmente, aspire el medio de mantenimiento basal y sustitúyalo con un mililitro de medio fresco. Precaliente más DPBS con calcio y magnesio. Añada tres mililitros de DPBS precalentado a un tubo de 15 mililitros y luego resuspenda colonias individuales de influenza no tipificable o NTHI cultivadas durante la noche en agar chocolate en el tubo.

Ahora agite el tubo vigorosamente durante al menos 10 segundos y luego mida la densidad óptica. Continúe añadiendo colonias individuales de NTHI hasta que la concentración bacteriana alcance una DO a 600 nanómetros de aproximadamente 0,7. A continuación, lave cada inserto de vía aérea EPI con DPBS precalentado como antes, y luego añada 28 microlitros de la suspensión bacteriana a la superficie apical de cada inserto.

Evite inocular el medio de mantenimiento basal. Luego, devuelva la placa al incubador para cuantificar primero el NTHI precalentado y posteriormente las placas de agar chocolate secas en superficie. A continuación, diluya en serie el inóculo de NTHI utilizando PBS estéril con gelatina al 0,1 % o PBSG.

Suelte alícuotas de 10 microlitros del inóculo sobre las placas y luego incube las placas durante la noche a 37 grados Celsius en un 5 % de dióxido de carbono. Al día siguiente, determine las UFC por mililitro contando la dilución que tenga entre 15 y 30 colonias distintas en cada gota y calculando a partir de este valor el inóculo viable real de NTHI para obtener el total de bacterias asociadas a las células. Enjuague la superficie apical de las vías respiratorias epi tres veces con 200 microlitros de DPBS sin calcio ni magnesio.

Luego incline el inserto y enjuague todo el medio de mantenimiento restante de la membrana basal. Coloque el inserto lavado en una placa de seis pocillos nueva y agregue 250 microlitros de solución estéril de saponina al 1% sobre la superficie apical de cada tejido. Devuelva la placa al incubador durante 10 minutos mientras la placa se incuba.

Prepare tubos para la dilución en serie, llenando cada tubo de dilución con 900 microlitros de PBSG. A continuación, frote el tejido de la membrana con una punta de pipeta P 1000 utilizando un movimiento de ida y vuelta, seguido de un movimiento circular para retirar el tejido de los bordes del inserto. Luego, utilizando una punta de pipeta P 1000 estéril de gran orificio, coloque la suspensión en un tubo einor de 1,5 mililitros vacío.

Ahora agregue 250 microlitros de DPBS sobre la superficie apical del inserto y luego examine el inserto utilizando un microscopio invertido de contraste de fases para determinar si queda algún tejido por cosechar. Añada la suspensión al tubo einor y complete con 500 microlitros de DPBS de forma enérgica. Vortexee la suspensión celular durante un minuto.

Luego, utilizando una jeringa estéril de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26, aspire la suspensión dentro de la jeringa a través de la aguja. Pase lentamente la suspensión a través de la aguja tres veces, teniendo cuidado de no crear burbujas.

Luego, agite vigorosamente la suspensión mediante vortex durante un minuto más. A continuación, utilice una punta de pipeta de gran apertura para transferir 100 microlitros de la suspensión al primer tubo de dilución. Agite el tubo vigorosamente mediante vortex durante cinco segundos, y luego realice una dilución seriada de uno a diez y aplique por goteo la dilución sobre placas de agar chocolate.

Luego, incubar las placas durante la noche a 37 grados Celsius en un 5% de dióxido de carbono para obtener recuentos bacterianos viables y cosechar las bacterias internalizadas. Lavar cada inserto solo tres veces con 200 microlitros de DPBS. Reemplazar el medio de mantenimiento basal con medio que contenga 100 microgramos por mililitro de sulfato de gentamicina, y luego añadir 300 microlitros del medio de mantenimiento que contiene gentamicina sobre la superficie apical.

Devuelva los insertos al incubador durante una hora; mientras los insertos se incuban, caliente previamente algo de DPBS. Luego, retire el medio de mantenimiento que contiene Gentamicina de la superficie apical. A continuación, lave extensamente la superficie apical y la membrana basal de los insertos con el DPBS previamente calentado.

Por último, repita el procedimiento de raspado y recolección que acaba de demostrarse antes de realizar diluciones seriadas y el aislamiento de las bacterias internalizadas en esta figura. Comparando las imágenes de microscopía electrónica de barrido de tejidos epi respiratorios no infectados a la izquierda con tejidos epi respiratorios infectados con NTHI a los cinco días a la derecha. Puede observarse que el cultivo prolongado con NTHI no provoca daños significativos en los tejidos apicales, lo que resalta la utilidad del modelo epi respiratorio.

Aquí se muestra una gráfica que representa el número de NTHI internalizados a lo largo del tiempo durante un cultivo co-cultivo de vías respiratorias epi. La cepa R 2 8 6 6 se inoculó aproximadamente a una vez 10 a la séptima UFC por inserto. Luego, las bacterias internalizadas se recolectaron y enumeraron en cada punto de tiempo indicado.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el cultivo conjunto a largo plazo de NTHI con los tejidos respiratorios hormonales primarios utilizando un modelo A PRE.