Disección de Host-virus Interacción en la replicación lítica de un Herpesvirus Modelo

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar diversos enfoques virológicos y bioquímicos para analizar el papel de una vía de señalización del hospedador en la replicación lítica de un virus herpes modelo. Aquí, como ejemplo, examinamos el papel de la proteína señalizadora antiviral mitocondrial Mavs durante la infección con el virus herpes gamma HV 68. Primero, para examinar el papel de Mavs durante la infección aguda, ratones de tipo silvestre y ratones knockout para Mavs son infectados con gamma HV 68 tras una infección viral aguda.

Se recolecta el pulmón de ratón y se determinan las cargas virales mediante un ensayo de placas en el que las muestras se diluyen seriamente y se siembran. Luego se cuentan el número de placas en monocapas. Una carga viral aumentada en los ratones knockout sugiere que el gen de interés desempeña un papel antiviral.

Por el contrario, la reducción de las cargas virales en ratones knockout indica que el gen es necesario para la infección viral. Para validar estos hallazgos, se examinan las cinéticas de crecimiento viral multietapa in vitro en fibroblastos embrionarios de ratón: fibroblastos embrionarios de ratón de tipo salvaje y knockout de mavs son infectados con el virus gammaherpes 68 y incubados durante diversos periodos de tiempo. Luego se recolectan las células y se realizan ensayos de placas para comparar las cinéticas de crecimiento multietapa entre células de tipo salvaje y células deficientes en mavs.

Para validar aún más estos hallazgos, se infectan células de fibroblastos embrionarios de ratón de tipo silvestre y con deleción de mavs con el virus gammaherpesvirus 68. Luego, se extrae por separado el ADN y el ARN de las células infectadas y se analizan los transcritos genómicos virales mediante PCR en tiempo real. Tuvimos por primera vez la idea de este protocolo cuando estudiamos el papel de una vía de inmunidad del huésped durante una infección lítica por virus.

Este protocolo podría aplicarse potencialmente para investigar las reglas de las vías de señalización del hospedador durante la infección por otros patógenos. Comience este procedimiento permitiendo que ratones macho y hembra de seis a ocho semanas de edad, procedentes de la misma camada, se aclimaten durante un período de cuatro días tras su recepción. El siguiente experimento se realizará en una instalación de riesgo biológico.

Como preparación, colóquese el equipo de protección personal, que incluye una bata de laboratorio, guantes, una mascarilla y fundas para zapatos, trabajando dentro de una cabina de seguridad biológica de nivel dos. Prepare la suspensión viral con 40 a 10.000 PFU de gamma HV 68 y 30 microlitros de PBS estéril para cada ratón que será infectado.

Mantenga la suspensión viral en hielo tras una inyección intraperitoneal de ketamina y xilacina. Asegúrese de que los ratones estén sedados realizando una compresión del dedo del pie. Luego, utilizando una pipeta, administre 30 microlitros de la suspensión viral gota a gota en la fosa nasal izquierda o derecha.

Coloque al ratón de lado durante cinco a 10 minutos para facilitar la administración del virus a las vías respiratorias y su llegada al pulmón. Luego, devuelva a los ratones a su jaula y obsérvelos hasta que se hayan recuperado completamente de la sedación. A continuación, se recolecta tejido pulmonar de los ratones inyectados para preparar un lisado celular y evaluar el título viral en diversos días posteriores a la infección.

Coloque los pulmones extraídos de ratones sacrificados en tubos estériles de 1,5 mililitros con tapón roscado que contengan 500 microlitros de perlas de zirconia-sílice de 1,0 milímetro, sobre hielo. Si no va a proceder al siguiente paso el mismo día, almacene las muestras a menos 80 grados Celsius.

De lo contrario, agregue un mililitro de DMEM frío sin suero. Coloque el tubo en un homogeneizador de perlas y presione inicio para homogeneizar los pulmones durante 30 segundos. Para evitar el sobrecalentamiento de la muestra, lo cual podría inactivar el virus.

Enfríe el tubo en hielo durante al menos un minuto tras 30 segundos de homogenización. Luego repita este proceso. A continuación, centrifugue el tejido homogenizado a 16.000 RCF a cuatro grados Celsius durante un minuto.

Tras la centrifugación, los restos celulares estarán en el fondo del tubo y los lípidos estarán en la superficie. Tome inmediatamente el sobrenadante como se muestra aquí para realizar un ensayo de placas utilizando una monocapa de NIH three T three o BHK 21. A continuación, se realiza un ensayo de placas para determinar la título viral presente en la muestra; comience el ensayo de placas realizando diluciones seriadas del sobrenadante viral.

Primero, utilizando una pipeta multicanal, agregue 270 microlitros de medio a una placa de 96 pocillos. Deje la primera fila en blanco. Luego, agregue 200 microlitros de sobrenadante a la primera fila de la placa de 96 pocillos, colocando cada muestra en triplicado.

A continuación, transfiera 30 microlitros de la muestra desde la primera fila a la siguiente fila y mezcle. Luego transfiera 30 microlitros de la mezcla a la siguiente fila y mezcle. Repita este paso varias veces para realizar diluciones seriadas de diez veces.

A continuación, agregue el sobrenadante viral diluido sobre la monocapa celular en una placa de 24 pocillos. Coloque la placa en un incubador y agite la placa cada 30 minutos durante una incubación de dos horas. Tras la incubación, para eliminar los restos celulares, aspire el sobrenadante de la placa.

Luego, lave las células una vez con medio fresco. Después del lavado, agregue medio que contenga metilcelulosa a las células. Incube las células durante cuatro a seis días.

Después de transcurridos cuatro a seis días, utilice un microscopio para leer el número de placas de cada muestra. Registre el número de placas para cada dilución.

Luego calcule la media y la desviación estándar. Las pocilas que contienen demasiadas o muy pocas placas no pueden utilizarse para calcular con precisión la titulación. Por lo tanto, para cada muestra, utilice una dilución en la que haya de siete a 70 placas.

Esta muestra diluida 1000 veces tiene un promedio de 23 placas por pocillo. Para calcular el título viral en la solución sin diluir, multiplique el factor de dilución por el número de placas por el número de microlitros en un mililitro. Luego divida eso por el volumen de sobrenadante diluido agregado por pocillo.

Entonces, en este ejemplo, 1000 multiplicado por 23 placas multiplicado por 1000 microlitros por mililitro dividido entre 100 microlitros equivale a 2,3 por 10 a la quinta unidades formadoras de placas por mililitro. A continuación, se utiliza una solución vírica con una titulación conocida para determinar la cinética de crecimiento del gamma HV 68 en fibroblastos embrionarios de ratón. Comience dividiendo mitos de tipo salvaje y aquellos deficientes en un gen huésped en una placa de 24 pocillos a 10.000 células por pocillo. Al día siguiente, sustituya el medio en cada pocillo por 0,5 mililitros de una suspensión de gamma HV 68 con una baja MOI.

Coloque la placa en el incubador a 37 grados Celsius y permita que la incubación continúe durante dos horas. Agite la placa cada 30 minutos tras la incubación. Utilice una pipeta para eliminar la suspensión viral y agregue 0,5 mililitros de DMEM completo fresco que contenga 8% de suero bovino fetal a las células infectadas con el virus.

Coloque las células nuevamente en el incubador en varios días posteriores a la infección. Recolecte el medio y las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Transfiera la muestra inmediatamente a tubos estériles de centrifugación de 1,5 mililitros y congele los tubos a menos 80 grados Celsius para liberar el gamma HV 68 de los Mets.

Realice tres ciclos de congelación y descongelación. Desele las células colocándolas a 37 grados Celsius. Luego, vortexee y colóquelas nuevamente en el congelador a menos 80 grados Celsius.

Determine el título viral mediante un ensayo de placas utilizando una monocapa de NIH three T three o BHK 21, como se mostró anteriormente, para examinar si la replicación de ADN o ARN se ve afectada por la deficiencia de genes del huésped o genes virales. Comience con células infectadas en varios días posteriores a la infección, deseche el sobrenadante, lave las células con PBS frío y agregue tripsina a las células en hielo. Luego, haga un pellet de las células mediante centrifugación a 1000 RCF a temperatura ambiente durante un minuto; tras la centrifugación, deseche el sobrenadante y almacene las células a menos 80 grados Celsius.

Extraiga el ADN y ARN totales, de origen tanto del huésped como viral. Luego centrifugue las columnas de centrifugación. Realice una PCR en tiempo real utilizando el ADN total y cebadores específicos para los transcritos virales en fase lítica.

Determine la cantidad relativa del genoma intracelular de gamma HV 68 en referencia a un gen de mantenimiento del huésped, como la beta actina. Prepare ADNc con ARN total y cebador oligo DT. Realice PCR en tiempo real utilizando ADNc y cebadores como se indicó anteriormente para determinar la cantidad relativa de transcritos virales.

En referencia al del gen de mantenimiento del hospedador Mavs, cuyo nombre completo es señalización antiviral mitocondrial, como se muestra aquí. La molécula adaptadora Mavs transmite la señalización desde los receptores citosólicos similares a rig eye hasta la activación de NF-kappa B y de los factores reguladores de interferón (IRFs), que a su vez aumentan la expresión génica de citocinas proinflamatorias e interferones. Aquí se muestran las cargas virales en el pulmón de ratones silvestres infectados con gamma HV y de ratones hermanos deficientes en Mavs.

La deficiencia en Mavs redujo significativamente las cargas virales en el pulmón a los 10 días posteriores a la infección, lo que indica que Mavs es necesario para una infección viral eficiente in vivo. Esta figura muestra una curva de crecimiento viral multietapa en fibroblastos embrionarios de ratón de tipo salvaje y en aquellos deficientes en Mavs. El crecimiento viral se retrasó significativamente en los fibroblastos embrionarios de ratón, lo que indica que Mavs es necesario para una replicación viral eficiente in vitro. Los niveles de ARNm de genes líticos virales en fibroblastos embrionarios de ratón infectados con el herpesvirus gamma 68 se analizaron mediante PCR en tiempo real. La deficiencia en Mavs redujo significativamente los niveles de ARNm de tres genes líticos esenciales.

Todos estos resultados respaldan colectivamente la conclusión de que Mavs es necesario para la activación de la transcripción del HV-68 gamma y para la replicación lítica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo investigar la interacción huésped-patógeno a múltiples niveles, tanto en VO como en Vevo. No olvide que trabajar con patógenos podría ser extremadamente arriesgado.

Se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal, durante la realización de los procedimientos.