La separación de una sola hebra de ADN, el ADN de doble cadena y el ARN de una comunidad ambiental viral mediante cromatografía de hidroxiapatita

Este video demuestra un procedimiento para separar ensamblajes virales mixtos según su composición de ácidos nucleicos. Esto permite estudiar la diversidad taxonómica y el potencial funcional de ensamblajes virales complejos. Aquí se emplea hidroxiapatita, una forma cristalina de fosfato de calcio, en la separación de ácidos nucleicos.

Primero, se empaqueta y equilibra una columna de hidroxiapatita; luego, se aplican los ácidos nucleicos virales purificados a la columna. La interacción de carga entre los iones de calcio con carga positiva de la hidroxiapatita y la estructura de fosfato con carga negativa de los subtipos de ácidos nucleicos une los ácidos nucleicos a la columna Nick. A continuación, se eluyen por separado el ADN de cadena sencilla, el ARN-ADN y el ADN de doble cadena utilizando concentraciones diferentes de tampón fosfato. Los ácidos nucleicos resultantes se desalan y concentran posteriormente para su visualización, cuantificación e identificación mediante secuenciación de ADN. La electroforesis en gel de agarosa confirma que las especies de ácidos nucleicos pueden separarse con menos del 9 % de arrastre.

Por lo tanto, este método permite la evaluación de la diversidad y la capacidad funcional de las comunidades virales. Hola, me llamo Doug Fro y soy investigador asociado en el laboratorio de la Dra. Shannon Williamson en el Instituto J. Craig Venture. Hoy les mostraré un procedimiento para separar ADN de cadena sencilla, ADN de doble cadena y ARN de un ensamblaje viral ambiental.

Este método presenta ventajas frente a los métodos existentes, como el tratamiento con el núcleo, que tiene como diana ya sea el ADN o el ARN. La cromatografía de hidroxiapatita tiene la capacidad de capturar toda la comunidad viral. Este método nos permite responder varias preguntas en el campo de la ecología viral.

Por ejemplo, ¿cuál es el complemento genético total o la diversidad de la comunidad viral? Primero pensamos en este método cuando quisimos estudiar todos los ensamblajes de plancton del río en la Bahía de Chesapeake sin sacrificar un subconjunto de la firma genética. Las soluciones necesarias para este experimento deben prepararse con anticipación según las instrucciones del protocolo escrito adjunto, e incluyen tampón fosfato 0,12 molar, tampón fosfato 0,20 molar, tampón fosfato 0,40 molar y solución fosfato un molar.

Todo a pH 6,8 y con hidroxiapatita hidratada el día del experimento, equilibre todos los tampones fosfato y la hidroxiapatita hidratada colocándolos en un baño de agua a 60 grados Celsius. Comience este procedimiento preparando la columna econo que se utilizará para la separación de ácidos nucleicos virales. Ate un grifo a extremo de la columna econo y asegúrese de que esté cerrado.

Utilizando una pipeta, agregue agua desionizada a la columna, luego coloque la tapa en la parte superior de la columna e inviértala repetidamente para enjuagarla. Vacíe el agua y repita este lavado varias veces. A continuación, retire la llave de cierre de la columna econ y autoclávela para esterilizarla.

La llave de paso no se autoclava porque se derretiría. Enjuague la llave de paso con agua ionizada, luego nuevamente con etanol al 70% y déjela secar al aire después de la autoclave. Reemplace la llave de paso y ciérrela.

A continuación, trabajando en una campana extractora, agregue un mililitro de sigma coat a la columna y recubra el vidrio de la columna invirtiéndola con un movimiento de rodado como se muestra aquí. El recubrimiento con sigma coat minimizará la adherencia de los ácidos nucleicos a la superficie de vidrio. Durante la separación, se han recubierto las superficies de vidrio salino.

Abrir la llave de paso y verter en un tubo cónico. A continuación, para conectar la columna a un baño de agua circulante, utilizar dos pinzas para fijar la columna a un soporte de anillo. Conectar el tubo de silicona proveniente del baño de agua circulante, de modo que el flujo de agua vaya de abajo hacia arriba.

Establezca la temperatura a 60 grados Celsius e inicie la circulación. Aunque en la práctica, la columna y los tubos se envolverían con un agente aislante, como papel de aluminio o aislamiento de espuma para tuberías. Para minimizar la pérdida de calor, este paso no se muestra aquí.

Para visualizar mejor el procedimiento, cierre la llave de paso. Mediante una pipeta, agregue 10 mililitros de agua estéril libre de RNAsas. Abra la llave de paso y permita que el agua drene.

Luego, lave nuevamente siguiendo el segundo lavado. Enjuague dos veces con 10 mililitros de tampón fosfato estéril libre de RNAsas de 0,12 molar y vierta entre cada lavado. La columna ya está lista para la cromatografía de hidroxipatita.

Asegúrese de que la llave de paso de la columna econ esté cerrada. Luego, utilizando una pipeta serológica estéril de dos mililitros, agregue lentamente dos mililitros del hidroxiapatita rehidratada y reconstituida preparada en la parte inferior de la columna. Vuelva a colocar la tapa de la columna.

Deje que el hidroxiapatito se sedimente por la fuerza de la gravedad durante 30 minutos. Este método requiere atención al detalle. La columna de hidroxiapatito procesa a una velocidad de 0,25 a 0,5 milímetros por minuto.

Por lo tanto, es muy importante vigilar de cerca la columna para que no se seque. Después de que hayan pasado 30 minutos, abra la llave de paso para drenar el tampón en un recipiente de desecho. Cierre la llave de paso y deseche el flujo filtrado.

Combine los ácidos nucleicos con tampón fosfato 0,12 M en un volumen final de 500 microlitros e incúbelos a 60 grados Celsius durante 10 minutos. Esto igualará la temperatura de los ácidos nucleicos con la de la columna y mejorará la separación de las diferentes especies de ácidos nucleicos al eliminar cualquier estructura secundaria que pudiera estar presente. Utilizando una pipeta serológica de dos mililitros, aplique rápidamente la solución de ácidos nucleicos sobre la hidroxiapatita, asegurándose de no perturbar la columna.

Una vez que los 500 microlitros completen el flujo hacia la columna, se puede agregar una pequeña cantidad de tampón fosfato 0,12 molar en la parte superior de la columna para evitar que se seque. Permita que los ácidos nucleicos se unan a la hidroxiapatita durante 30 minutos. Tras la incubación de unión, coloque un tubo cónico de 15 mililitros debajo de la columna.

Luego, abra la llave de paso y recoja la muestra inicial de 500 microlitros, que contiene ADN de cadena sencilla. Una vez que se hayan recolectado 500 microlitros, cierre la llave de paso. A continuación, agregue seis mililitros de tampón fosfato 0,12 molar a la hidroxiapatita, asegurándose de no perturbar la columna.

Luego, abra la llave de paso y continúe recolectando el flujo que atraviesa, que contiene ADN de cadena sencilla, en el mismo tubo de 15 mililitros del paso anterior. Después de recolectar aproximadamente seis mililitros, cierre la llave de paso. Añada un volumen igual de una solución de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico al tubo y mezcle vigorosamente mediante vortex, luego centrifugue a 3.500 ×g durante 15 minutos.

Tras la centrifugación, el tubo contendrá dos capas. Transfiera la capa superior acuosa, que contiene la cadena simple de ADN, a un nuevo tubo de 15 mililitros y almacene la muestra a temperatura ambiente para eluir y purificar el ARN de la columna, agregue seis mililitros de tampón fosfato 0,20 molar y recoja los flujos descendentes utilizando un tubo nuevo de 15 mililitros. Luego, realice una extracción con fenol-cloroformo.

En cuanto a la muestra de ADN de cadena sencilla, repita este proceso utilizando seis mililitros de tampón fosfato 0,40 molar para eluir y purificar el ADN de doble cadena de la columna. Finalmente, para eliminar cualquier resto de ADN de doble cadena de la columna, repita este proceso una vez más.

Esta vez utilizando seis mililitros de tampón fosfato 1,00 molar para desalar las muestras de ácidos nucleicos. Transfiera cuatro a cinco mililitros de cada muestra a un dispositivo de filtro centrífugo Ultra cuatro equipado con una membrana de célula ultra con corte de peso molecular de 30.000 para concentrar la muestra a menos de 500 microlitros mediante centrifugación a 6.000 × g a 30 grados Celsius durante aproximadamente cinco minutos en un rotor de ángulo fijo. Después de desechar el flujo atravesante, agregue el resto de las muestras al filtro.

Añada tampón 1 XTE libre de ARN hasta alcanzar un volumen de cuatro a cinco mililitros. Luego, centrifugue nuevamente hasta obtener un volumen concentrado. Aproximadamente cinco minutos después de la centrifugación, agregue cuatro a cinco mililitros de tampón 1 XTE libre de ARN al filtro y concentre.

Repita nuevamente este lavado y adicional cinco veces para desalar completamente las muestras de ácidos nucleicos. Una vez que las muestras hayan sido completamente concentradas y desaladas, transfiera las muestras restantes de ácidos nucleicos a un tubo estéril de microcentrífuga de 1,7 mililitros. Precipite los ácidos nucleicos añadiendo una décima parte del volumen de acetato de sodio, dos volúmenes de etanol al 100 % y un microlitro de azul de glicerol, mezclando bien mediante vortex y centrifugación.

Un 28.000 GS a cuatro grados Celsius durante 60 minutos en Kent. Asegurándose de no perturbar el precipitado.

Añada 300 microlitros de etanol al 70 %, centrifugue a 28.000 ×g a temperatura ambiente durante 10 minutos, no seque y reconstituya cada fracción en un volumen apropiado de tampón TE libre de ARN. Se combinaron concentraciones iguales de ácidos nucleicos virales: M13 MP18, ADN de cadena simple; MS2, ARN de cadena simple; FI6, ARN de doble cadena; y ADN de doble cadena Lambda, y luego se separaron mediante cromatografía de hidroxiapatita, como se muestra en este video. Se combinaron concentraciones iguales de M13 MP18, ADN de cadena simple; MS2, ARN de cadena simple; FI6, ARN de doble cadena; y ADN de doble cadena Lambda, como se muestra en la banda seis, y se aplicaron a una columna de hidroxiapatita, como se puede observar aquí.

Se eluyeron independientemente el ADN-RNA de cadena sencilla y el ADN de doble cadena de la columna de hidroxiapatita utilizando tampón fosfato 0,12 molar, 0,18 molar, 0,40 molar y 1,00 molar. Se utilizó un marcador de 1 KB para confirmar los tamaños del genoma. Estos resultados indican que este método puede emplearse para separar con éxito el ADN de cadena sencilla, el ADN de doble cadena y el ARN con menos del 9 % de arrastre de una fracción a la siguiente.

Este método también se utilizó para separar ácidos nucleicos aislados de una comunidad viral dentro de la Bahía de Chesapeake, como se muestra aquí. El ADN-RNA de cadena sencilla y el ADN de doble cadena se eluyeron independientemente utilizando concentraciones de tampón fosfato de 0,12 molar, 0,20 molar y 0,40 molar, o 1,00 molar, respectivamente. Una escalera de ADN de alto peso molecular en la banda uno y una escalera de 1 KB en la banda dos se utilizaron para confirmar visualmente el peso molecular y la masa aproximados de los ácidos nucleicos, como puede observarse aquí. El ADN de doble cadena fue el tipo predominante de ácido nucleico extraído del plancton viral de la Bahía de Chesapeake. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo separar ácidos nucleicos de un ensamblaje viral mixto utilizando cromatografía de hidroxiapatita.

Esto incluye la preparación de la columna de hidroxiapatita y los ácidos nucleicos, la separación y elución de los ácidos nucleicos utilizando diversas concentraciones de tampón fosfato y desalado, y la concentración de los ácidos nucleicos después de la separación.