La criopreservación de embriones de ratón por el etileno a base de glicol vitrificación
18 de noviembre de 2011
Un etilenglicol basado en el método de vitrificación de embriones de ratón se describe. Es conveniente que otros métodos en su simplicidad y la toxicidad embrionaria bajo, y por lo tanto se puede aplicar ampliamente a muchas cepas de ratones, incluyendo ratones endogámicos y el gen modificado.
El objetivo general de este procedimiento es criopreservar embriones de ratón en nitrógeno líquido y descongelarlos para recuperar ratones vivos. Esto se logra primero sumergiendo los embriones de ratón en medio de equilibrio, transfiriéndolos luego a medio de vitrificación en un tubo criogénico y colocándolos finalmente en un tanque de nitrógeno líquido. Posteriormente, los embriones pueden descongelarse en un medio de alta osmolaridad e incubarse en medio de cultivo hasta que se transfieran a hembras receptoras.
En última instancia, los resultados muestran una supervivencia de más del 90 % de los embriones tras la descongelación por vitrificación, y tasas de natalidad entre el 30 y el 70 % tras la transferencia embrionaria. La principal ventaja de esta técnica es que el crioprotector permeable, el glicol, es menos tóxico para los embriones que los crioprotectores convencionales. La realización del procedimiento será demostrada por un técnico de mi laboratorio antes de comenzar este protocolo.
Prepare embriones de dos células de ratón en cultivo obtenidos por apareamiento natural o técnicas convencionales de fertilización in vitro (FIV) en un tubo criogénico para almacenamiento futuro; agregue 50 microlitros de solución de congelación de embriones EF S 40. Luego, prepare una placa de Petri plástica de 35 milímetros o 60 milímetros con 50 microlitros de EFS 20 a temperatura ambiente.
Utilice una micropipeta de vidrio para transferir hasta 30 embriones al platillo. Tenga cuidado de evitar la transferencia del medio de cultivo. Además, para asegurar la deshidratación de los embriones, colóquelos en la parte inferior de la gota.
Después de aproximadamente 60 a 90 segundos, utilice un tubo capilar para aspirar embriones deshidratados. Con una morfología encogida. Transfiera estos embriones a la solución EFS en el tubo criogénico, transfiriendo la menor cantidad posible de EFS 20.
Una vez transferidos los embriones, déjelos asentar en el EFS 40 durante un minuto antes de congelarlos en nitrógeno líquido. Antes de descongelar los embriones, coloque en un plato de cultivo al menos dos gotas de medio de cultivo embrionario de alta osmolaridad de 10 microlitros, como el medio M 16. Luego cubra completamente las gotas con aceite de silicona o mineral, y coloque el plato en una incubadora de dióxido de carbono hasta su uso.
A continuación, caliente la solución TS uno a 37 grados Celsius mientras usa una mascarilla facial y guantes criogénicos. Retire los embriones del tanque de nitrógeno líquido. Abra rápidamente el tubo criogénico y deseche cualquier nitrógeno líquido en el tanque o en un recipiente adecuado.
Luego espere 30 segundos. Ahora agregue 850 microlitros de la solución tibia de TS uno al tubo criogénico. Aspire y expulse suavemente la solución aproximadamente 10 veces para que se disuelva uniformemente.
Luego transfiera todo el volumen a una placa de Petri plástica de 60 milímetros. O espere tres minutos en un vidrio de reloj para que los embriones se equilibren a la temperatura ambiente, donde deben permanecer durante el resto del procedimiento. No utilice un dispositivo de calentamiento.
Examine rápidamente los embriones en la placa bajo un microscopio estereoscópico para observar cómo se ven al inicio de esta incubación. Después de aproximadamente dos minutos de incubación, hunda los embriones agitando suavemente la placa hasta que el medio se distribuya sobre la superficie de la misma. En el último minuto de la incubación, expulse tres gotas separadas de 50 microlitros de la solución TS dos en una placa.
Una vez transcurridos los tres minutos, utilice un microscopio estereoscópico para confirmar que los embriones han encogido ligeramente. Si los embriones aún están hinchados, continúe la incubación durante uno a tres minutos más. Ahora, recoja los embriones con una capilar de vidrio y transfiéralos a la primera gota de TS dos.
Espere tres minutos y transfiera los embriones a la segunda gota. A continuación, pase a la tercera gota. Finalmente, retire el plato con medio para embriones preparado que se encuentra almacenado en el incubador, y utilice una capilar de vidrio para transferir los embriones a la primera gota del medio.
Si se examinan bajo un estereoscopio, los embriones deben recuperar lentamente su morfología normal. Ahora, devuelva el recipiente al incubador durante aproximadamente 10 minutos. Luego, lave para eliminar la sacarosa que se ha transferido del TS dos.
Trasladar los embriones a la siguiente gota de medio de cultivo. Continuar el cultivo de los embriones en el incubador de CO2 hasta que se transfieran al útero de hembras receptoras. Después de vitrificar y recuperar entre 300 y 480 embriones de tres cepas diferentes de ratón, la viabilidad fue muy alta.
Después del descongelamiento, la fracción de embriones que mostraban morfología normal fue entre 93 y 99 %, y de esos embriones, al menos el 84 % se desarrollaron en blastocistos. No olvide que trabajar con fugas de nitrógeno puede ser extremadamente peligroso y que se deben tomar precauciones para evitar el contacto directo y minimizar la exposición a corta distancia con la fuga. El nitrógeno siempre debe manejarse realizando este procedimiento.
Descripción general
Este artículo describe un método de vitrificación basado en etilenglicol para la criopreservación de embriones de ratón. Esta técnica es ventajosa debido a su simplicidad y baja toxicidad embrionaria, lo que la hace adecuada para diversas cepas de ratón.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología reproductiva
- Embriología
Antecedentes
- La vitrificación es un método utilizado para preservar muestras biológicas a bajas temperaturas.
- Los crioprotectores convencionales pueden ser tóxicos para los embriones.
- El etilenglicol es una alternativa menos tóxica para la preservación de embriones.
- Este método puede aplicarse a ratones endogámicos y modificados genéticamente.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método sencillo y eficaz para la criopreservación de embriones de ratón.
- Evaluar las tasas de supervivencia y natalidad de los embriones tras la vitrificación y descongelación.
- Proporcionar un protocolo que pueda ser ampliamente adoptado en laboratorios.
Métodos Utilizados
- Los embriones se sumergen en medios de equilibración y vitrificación.
- Los embriones se almacenan en nitrógeno líquido para criopreservación.
- El descongelamiento implica transferir los embriones a un medio de alta osmolaridad.
- Los embriones se cultivan hasta que están listos para ser transferidos a hembras receptoras.
Resultados principales
- Se observaron tasas de supervivencia superiores al 90% tras el descongelamiento.
- Las tasas de natalidad oscilaron entre el 30% y el 70% tras la transferencia de embriones.
- Los embriones mostraron recuperación normal de la morfología tras el descongelamiento.
- Se registraron altas tasas de desarrollo hasta blastocistos.
Conclusiones
- El método basado en etilenglicol es efectivo para la criopreservación de embriones de ratón.
- Esta técnica minimiza la toxicidad embrionaria en comparación con los métodos tradicionales.
- Es una opción viable para diversas cepas de ratón en la investigación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La criopreservación robusta de embriones de ratón genéticamente diversos sustenta la continuidad de la investigación traslacional y la flexibilidad en la cadena de producción de biofármacos. La vitrificación basada en etilenglicol permite una alta supervivencia embrionaria y una amplia aplicabilidad entre cepas, favoreciendo la gestión escalable de colonias y la preservación de recursos genéticos. Este método reduce el riesgo biológico y las barreras operativas para el acceso a modelos preclínicos en diversos programas de descubrimiento y desarrollo.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite archivar de forma segura y recuperar rápidamente modelos de ratones genéticamente modificados para estudios basados en hipótesis.
- Apoya la validación funcional de objetivos al garantizar un acceso constante a sistemas in vivo validados.
- Facilita la selección de carteras al mantener un suministro listo de diversos antecedentes genéticos para la reducción de riesgos mecanicistas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona embriones estandarizados con alta viabilidad para cribados fenotípicos y desarrollo de ensayos posteriores.
- Asegura la reproducibilidad y escalabilidad en la generación de cohortes preclínicas a partir de stocks criopreservados.
- Reduce la variabilidad en las entradas biológicas, apoyando flujos de trabajo confiables para la evaluación de compuestos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Mantiene modelos genéticos relevantes para la enfermedad, permitiendo comparaciones longitudinales y entre estudios.
- Posibilita la continuidad desde el descubrimiento inicial hasta la validación preclínica mediante la protección de cepas críticas.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al garantizar la disponibilidad del modelo para estudios confirmatorios.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
Este protocolo de vitrificación se integra en la interfaz entre la generación de modelos, el manejo de colonias y el inicio de estudios preclínicos, permitiendo una transición fluida desde la ingeniería genética hasta la validación in vivo.
- Biología del Descubrimiento: Conserva modelos genéticos validados para pruebas iterativas de hipótesis y análisis de vías.
- Cribado: Proporciona embriones de alta calidad para el desarrollo de ensayos reproducibles y campañas de cribado.
- Análisis: Ofrece lecturas cuantitativas de supervivencia y desarrollo para evaluar el rendimiento de la criopreservación.
- Investigación Traducional: Asegura la continuidad del modelo para la alineación de biomarcadores y estudios traslacionales.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de criopreservación estandarizada y reutilizable en todos los programas de I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista al mantener la fidelidad del modelo.
- Valor operativo: Optimiza la gestión de colonias mediante criopreservación y recuperación escalables y reproducibles.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al garantizar la disponibilidad del modelo.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo y el avance rápido de objetivos validados.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia técnica en el manejo de embriones y en protocolos de criopreservación.
- Necesita acceso a almacenamiento de nitrógeno líquido e infraestructura para descongelación controlada.
- Exige estandarización entre equipos para lograr una recuperación y uso posterior consistentes.
- Adaptable a una amplia variedad de cepas de ratón, con optimización del protocolo según sea necesario.
- Las precauciones de seguridad son esenciales al manipular materiales criogénicos.
