Crear transitoria poros de la membrana de células utilizando una impresora de inyección de tinta estándar

El objetivo general de este procedimiento es crear poros transitorios en las membranas celulares utilizando impresión por inyección de tinta. Esto se logra primero modificando una impresora de inyección de tinta estándar. El segundo paso consiste en vaciar y limpiar un cartucho de tinta para impresora convencional, con el fin de permitir la inserción de la tinta biológica.

A continuación, las células de interés se suspenden en una solución de monómeros de actina marcados con fluorescencia y PBS para crear la solución de bio-tinta. El paso final consiste en imprimir la bio-tinta sobre portaobjetos utilizando la impresora y el cartucho modificados. En última instancia, se puede utilizar la microscopía de fluorescencia para demostrar que los monómeros de actina G conjugados con Fluor cuatro han sido internalizados por las células impresas a través de poros transitorios en la membrana.

La principal ventaja de esta técnica frente a las técnicas estándar de transfección y microinyección celular es que esta técnica de impresión es fácil de usar y proporciona una alta viabilidad celular. Aunque esta técnica puede aportar información sobre genética, también puede aplicarse a otros campos de estudio, como la biofísica celular e ingeniería de tejidos en biofísica celular. Esta técnica puede utilizarse para observar fácilmente el citoesqueleto de una célula durante la migración celular.

Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando deseábamos poder visualizar los cambios en la disposición del citoesqueleto debidos a fuerzas aplicadas sobre las células. Comience por desbloquear las abrazaderas de plástico de la base inferior de la impresora y luego levante lentamente la cubierta superior de plástico. A continuación, desacople el panel luminoso del botón de visualización de la parte superior de la impresora, dejándolo conectado a la placa base de la impresora.

Utilizando toallas Kim y etanol, limpie el interior de la impresora, especialmente las áreas donde descansa el cartucho de tinta y donde se realiza la impresión. A continuación, localice el cable que suministra energía a los mecanismos de alimentación de papel de la HP Desk Jet 500.

Están justo debajo de la bandeja de papel, a la izquierda del frente; desconecte los cables de la placa base. Ahora localice el mecanismo de detección de papel y sujete un lazo de alambre al brazo de plástico gris ubicado arriba y detrás del mecanismo de alimentación del papel para usarlo como mango manual; coloque una plataforma aquí. El soporte de espuma para el envío de 15 tubos de centrífuga se utiliza junto con varias portaobjetos de microscopio fijados con cinta en la zona de impresión, frente al mecanismo de alimentación de papel, con el fin de colocar los portaobjetos deseados a un nivel ligeramente inferior al cabezal de impresión del cartucho.

Finalmente, para mantener la técnica aséptica, coloque la impresora dentro de una cabina de flujo laminar. Comience por retirar el cartucho de su empaque, dejando la cinta protectora que cubre los contactos de la impresora y la cabeza de impresión. Estabilice el cuerpo del cartucho con una abrazadera, dejando la parte superior verde libre de cualquier obstáculo, utilizando una herramienta de corte rotatoria manual.

Corte la parte superior verde del cartucho, vacíe cualquier tinta restante del depósito y luego retire la cinta protectora de plástico que cubre los contactos de la impresora y la cabeza de impresión. Es probable que el agua se filtre por la cabeza de impresión durante este proceso, pero no causará ningún daño al cartucho. Cuando el agua salga clara, deje que el cartucho se seque.

Para mantener un entorno de impresión limpio, comience por sumergir completamente el cartucho en un vaso de precipitados lleno de agua desionizada y luego someta el cartucho a sonicación durante 15 minutos. Después de la sonicación, retire el cartucho y agite para eliminar el exceso de agua. Rocíe etanol al 70 % dentro del cartucho para crear un ambiente más aséptico.

Después de recolectar las células de interés, centrifugue las células en cinco mililitros de medio fresco en un tubo cónico de centrífuga de 15 mililitros durante cinco minutos a 250 ×g a temperatura ambiente. A continuación, aspire el medio y luego resuspenda las células a una concentración de 1 × 10⁵ células por mililitro en solución stock recién preparada de actina G fluorescente. Para crear la bio-tinta, tenga en cuenta que 250 microlitros de bio-tinta imprimen tres cubreobjetos con el patrón de líneas mostrado aquí. Después de encender la impresora y calentarla, coloque la superficie de impresión deseada aquí; se utilizan cubreobjetos de 22 milímetros por 22 milímetros en el centro de la plataforma previamente ensamblada.

A continuación, abra un programa de dibujo y seleccione el patrón deseado. Ahora, pipetee aproximadamente de 100 a 120 microlitros de la suspensión celular en el pequeño pozo circular en la parte inferior del compartimento del cartucho. Imprima el archivo mientras la impresora se calienta nuevamente; el cartucho se moverá a la posición lista.

Cuando el cartucho se mueve ligeramente hacia la izquierda del pozo de goteo de tinta y permanece allí, tire hacia arriba del mecanismo de alimentación de papel; entonces el alambre y la impresión comenzarán. La impresora imprimirá sobre el cubreobjetos colocado en el centro de la plataforma de impresión utilizando una impresora HP DeskJet 500 con una biotinta compuesta por una suspensión de células fibroblastos en una solución de monómeros de G-actina.

En el interior de un cartucho de tinta HP serie 26, se imprimieron células sobre cubreobjetos de vidrio para microscopio. Esta figura ilustra un resultado representativo de células de fibroblastos impresos que muestran monómeros de actina fluorescentes incorporados. Este patrón se utilizó en la figura anterior para crear una línea continua de la solución de impresión a lo largo de la mayor parte del portaobjetos.

En esta figura, se muestra la línea recta en la que el biolink y las células fueron depositados mutuamente. Tenga en cuenta que inmediatamente después de la impresión, hay un aumento en la fluorescencia de fondo porque la solución de biolink en la que las células están suspendidas contiene monómeros fluorescentes de actina en exceso; incubar las células durante aproximadamente 10 minutos después de la impresión facilita la adhesión al portaobjetos, permitiendo que la solución excedente de monómeros sea lavada del sustrato con medio de crecimiento fresco, reduciendo significativamente la fluorescencia de fondo. Aquí, se presenta una imagen representativa de tres fibroblastos T3 impresos en una zona de impresión localizada; como se muestra, esta microfotografía de microscopía fluorescente de una célula tomada 15 minutos después de la impresión muestra la actina en verde, el núcleo en azul y la superposición de ambos, el GI de actina y el colorante nuclear.

Las siguientes dos imágenes muestran la microscopía de fluorescencia de dos fibroblastos en un patrón lineal tres horas después de la impresión. Esta primera imagen muestra monómeros de actina marcados con fluorescencia dentro de las células. Esta segunda imagen es una superposición del canal de fluorescencia con la imagen de fondo, lo que demuestra que, aunque puede haber algunos restos en la diapositiva en la esquina inferior izquierda, estos no presentan fluorescencia.

Finalmente, aquí se presenta un grupo control de células no impresas incubadas durante tres horas con monómeros marcados con fluorescencia para demostrar que los monómeros no pueden atravesar la membrana celular sin la permeación de la membrana mediante la impresión celular. Al intentar este procedimiento, es importante tener varios cartuchos limpios y listos para usar, ya que el atasco del impresor es uno de los problemas que ralentiza esta técnica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo convertir una impresora de escritorio estándar para imprimir células vivas, lo que ayuda a crear una fuerza transitoria en la membrana.