Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

El objetivo general de este procedimiento es inferir la tropismo viral en un paciente infectado con VIH mediante la secuenciación de la región V tres del gen del envoltorio viral, para lo cual se comienza por extraer el ARN del VIH del plasma sanguíneo del paciente. A continuación, se amplifica la región V tres del GP uno 20 del VIH utilizando RT-PCR anidada. Luego, se identifica la presencia del producto mediante electroforesis en gel, seguido de la secuenciación basada en población de los productos V tres amplificados.

Finalmente, analice las secuencias utilizando software de llamado de bases e infiera el uso de co-receptores mediante el algoritmo de genoma a fenotipo. En última instancia, estos resultados pueden mostrar si la tropismo viral de un paciente es R5 o no R5 mediante la secuenciación basada en población del bucle V3 del VIH. Por lo tanto, la ventaja principal de esta técnica de ensayo de tropismo frente a métodos existentes, como los ensayos fenotípicos basados en células, es que puede realizarse en cualquier laboratorio equipado con aparatos de secuenciación, con menor costo, en menos tiempo y con menor cantidad de material inicial.

Esta técnica es relevante para el tratamiento con terapia antirretroviral porque puede determinar si la población viral de un paciente probablemente responderá a un antagonista de CCR cinco. A partir de 500 microlitros de plasma, utilice un extractor automatizado Easy Mag para extraer el ARN del VIH. A continuación, trasládese a una sala limpia para PCR para preparar la RT-PCR, con el fin de garantizar un muestreo adecuado de la población viral.

Planifique realizar cada reacción de transcripción inversa por triplicado en esta reacción de un solo paso. Utilice ARN viral para sintetizar ADNc, amplificando específicamente la región tres de HIVV con SQV tres F1 y CO 6 0 2 prime repair. Según los componentes por reacción.

Prepare una solución stock suficiente para el número de muestras que se van a amplificar utilizando una pipeta repetidora. Añada 36 microlitros de la mezcla de muestra a cada pocillo de la placa de PCR. Ahora cambie a una pipeta multicanal para transferir microlitros del extracto de la muestra de ARN a cada uno de los pocillos designados. Tenga cuidado de cambiar las puntas entre cada adición.

Una vez completada la transferencia, cubra los pocillos con tapas de tira para PCR. Luego coloque la placa de PCR en un termociclador programado para una reacción de RT-PCR en un solo paso de la región tres del VIH. Para la PCR anidada, utilice el par de cebadores SQV tres F dos y reparación del cebador CD cuatro R.

Calcule la cantidad de reactivo necesaria para el número de muestras que se amplificarán en una sala limpia de PCR. Prepare la mezcla de PCR anidada y luego utilice una pipeta repetidora para aliquotar 19 microlitros por pocillo en una placa de PCR limpia. Tras completar la R-T-P-C-R, trasládese a una sala de postamplificación.

Utilice una pipeta multicanal de ocho canales para transferir un microlitro de la plantilla de R-T-P-C-R a la mezcla de PCR anidada. Cambie las puntas entre cada adición. Cubra los pocillos con tapas en tira para PCR y transfiera la placa a un termociclador para la amplificación.

Retire la placa del termociclador después de que la temperatura haya regresado a 25 grados Celsius. Para confirmar que la región V tres se ha amplificado con éxito, analice primero los productos mediante electroforesis en gel. Prepare un gel de AROS al 1.6 % con tinción segura para el gel cyber.

Utilizando una pipeta multicanal de 10 microlitros, transfiera ocho microlitros de muestras de PCR a los pozos respectivos. También cargue un marcador de ADN en al menos un pozo por fila.

Corra el gel a aproximadamente 100 voltios durante 10 minutos. Visualice las bandas mediante fluorescencia ultravioleta y documente la imagen por fotografía. Registre los ejemplares en los que las tres amplificaciones por triplicado fueron exitosas.

Si es necesario, repita la R-T-P-C-R para aquellas muestras con menos de tres amplificaciones del producto. Las muestras amplificadas de ADNc viral se verifican además mediante reacciones de secuenciación de ADN que se realizarán utilizando los cebadores V 3 0 2 F y S QV tres R uno. Retire el reactivo grande di del congelador y deshiélelo a temperatura ambiente.

Calcule y prepare los reactivos necesarios para el número de muestras que se van a analizar. Aliquote cinco microlitros de la mezcla de reacción de secuenciación en los pozos adecuados de la placa utilizando una pipeta multicanal. Cubra la placa con una toalla Kim y déjela aparte.

Mientras tanto, prepare una dilución de uno a 15 del producto PCR amplificado añadiendo 180 microlitros de agua estéril al producto PCR restante. Pipetee un microlitro de la muestra diluida hasta el fondo de la placa adecuada. Cambie siempre las puntas entre muestras cuando la transferencia de la muestra esté completa.

Selle la placa con tapas en tira y vortexee durante un segundo. Para centrifugar la placa, ajuste la velocidad a 140 5G. Cuando la velocidad de giro alcance 140 5G, detenga la centrifugación.

Coloque la placa en un termociclador para que la reacción transcurra. En cada pocillo, precipite el ADN con cuatro microlitros de acetato de sodio 3 M y 40 microlitros de etanol al 95 % frío, y vuelva a sellar las tapas. Centrifugue la placa durante 10 segundos y golpee suavemente la placa para desprender cualquier burbuja de aire.

Coloque las placas a menos 20 grados Celsius durante un período comprendido entre 30 minutos y dos horas. Recupere el ADN mediante centrifugación a 2000 G durante 20 minutos. Retire y deseche las tapas de tira.

Dar la vuelta a la placa sobre el recipiente de desecho y verter el sobrenadante. Eliminar cualquier sobrenadante restante presionando suavemente las placas invertidas sobre una toalla de papel.

Doble dos hojas de papel absorbente para colocar la placa entre ellas. Coloque la placa boca abajo en la centrífuga y gire a 140 5G. Detenga la centrifugación cuando alcance 140 5G.

Luego, lave con 155 microlitros de etanol al 95% y vierta el sobrenadante. A continuación, repita la centrifugación. Deje la placa reposar durante dos a cinco minutos para permitir que el etanol residual se evapore completamente.

Para desnaturalizar las muestras de ADN, utilice una pipeta multicanal para distribuir 10 microlitros de colorante alto para maide en todos los pocillos de la placa, incluidos los que están vacíos. Selle la placa con una septima y colóquela en un termociclador a 90 grados Celsius durante dos minutos. Finalmente, coloque la placa de muestras en una placa de secuenciación y luego en el secuenciador.

Una ruta aceptable para el análisis de datos es el uso del software Recall para realizar la llamada automática de bases sin intervención humana. Recall es un software gratuito basado en personalización; inicie sesión y seleccione los archivos de muestra para cargar mediante la opción de exploración. Localice el archivo de datos de secuenciación en bruto y cárguelo, hasta un máximo de 20 megabytes.

A continuación, establezca la secuencia de referencia en V tres. Haga clic en procesar datos. Seleccione la carpeta resultante en el lado derecho de la página para mostrar la lista de muestras.

Los que son rojos han fallado. Los que son verdes han aprobado. Al hacer clic en una muestra específica y en el botón de vista, puede revisar la secuencia, seguir las instrucciones del lado derecho de la página para navegar a través de la secuencia y descargar archivos en una carpeta comprimida en formato zip.

El tropismo viral se puede inferir a partir de secuencias generadas mediante secuenciación basada en poblaciones, utilizando el algoritmo genotipo a fenotipo del coreceptor. En el menú desplegable de la configuración significativa, seleccione la opción optimizada según el análisis de datos clínicos de motivate al 2% y 5,75% FPR. Ahora, elija cargar o pegar una secuencia para su análisis.

Se aceptan archivos FASTA. No agregue otros procedimientos para obtener un predictor genotípico FPRA de la respuesta a antagonistas de CCR cinco. El informe G dos P generado proporciona la secuencia del bucle V tres en aminoácidos e indica las posiciones relevantes de las mutaciones asociadas con virus no R cinco.

En la parte inferior del informe, se proporciona la tasa de falsos positivos y se interpreta en términos de respuesta a un antagonista de CCR5. Este informe puede descargarse como un archivo PDF. Si se infiere que cualquiera de las tres secuencias de una muestra no es R5, es poco probable que el paciente responda a un antagonista de CCR5 según lo esperado. La electroforesis en gel de las amplificaciones por RTP-PCR del bucle V3 del VIH-1 indica que no todas las muestras clínicas producen un producto.

Las secuencias generadas a partir de las muestras amplificadas pueden visualizarse en un cromatograma leído mediante recuperación. Se espera una secuencia limpia con pocas mezclas. Ocasionalmente, las secuencias pueden ser confusas y no adecuadas para la asignación precisa de bases.

Algunos pacientes pueden identificarse como portadores de virus que no utilizan CCR5, como se muestra aquí. Es poco probable que estos pacientes respondan al tratamiento con un antagonista de CCR5. Sin embargo, la mayoría de los pacientes presentan una población viral compuesta por virus que utilizan CCR5, como indica el cuadro verde en la parte inferior del informe de análisis G2P.

Así, una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente cuatro días de principio a fin, desde la extracción hasta el análisis. Después de ver este video, deberían tener una buena comprensión de cómo predecir el tropismo viral utilizando métodos de secuenciación basados en poblaciones junto con el algoritmo bioinformático genome pheno.

Muy bien, eso es todo. Gracias por verlo y buena suerte con sus experimentos.