Sola célula de mapeado de destino en el pez cebra

El objetivo general del siguiente experimento consiste en realizar un mapeo de destino y un seguimiento de la linaje de células individuales seleccionadas en embriones de pez cebra. Esto se logra mediante la conjugación química de fluoresceína encageada a dextrano de alto peso molecular. A continuación, el dextrano con fluoresceína encageada preparado se microinyecta en embriones de pez cebra, los cuales se activan posteriormente con luz en células seleccionadas utilizando absorción de dos fotones.

Después de la activación mediante luz de los embriones, se realiza un análisis inmunohistoquímico para detectar el dextrano de fluoresceína desencapsulado con el fin de trazar el destino de las células activadas. En última instancia, este método puede utilizarse para determinar la contribución linaje y la localización tisular de las células individuales activadas por luz. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la microscopía de fluorescencia estándar, es que permite etiquetar diferencialmente células individuales para el trazado fiel del destino celular.

Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en biología del desarrollo, como cómo las células precursoras indiferenciadas pueden contribuir a diferentes tipos de tejidos. La demostración visual es fundamental, ya que los pasos de montaje del embrión y activación fotónica son difíciles de aprender únicamente a partir de una descripción textual. Antes de comenzar, sintetice dextrano de fluoresceína enjaulada y almacénelo en tubos cubiertos con papel de aluminio. Luego, inyecte microscópicamente embriones en la etapa de una a dos células con el dextrano de fluoresceína enjaulada sintetizado.

Una vez que los embriones hayan alcanzado la etapa adecuada de desarrollo, revístalos. Luego, monte los embriones revestidos en agarosa de bajo punto de fusión para la activación fotónica. Cuando el agar haya solidificado, cargue el software LSM cinco 10.

Coloque un filtro amarillo transparente en la trayectoria del haz de luz blanca y luego seleccione escanear una nueva imagen y haga clic en iniciar modo experto. Seleccione la pestaña de láser, encienda las fuentes de láser de argón-hierro y de mi tai. Establezca la longitud de onda de mi tai en siete cuarenta nanómetros.

A continuación, seleccione la pestaña de configuración. Establezca las configuraciones de la trayectoria óptica para el ion argón y el láser mi tai. Luego, seleccione la pestaña de escaneo.

Cambie el objetivo a 20 veces 0,8. Establezca la velocidad máxima de escaneo haciendo clic en el método de modo máximo y estableciendo el número en media de línea y uno, respectivamente, en la pestaña de canales; desactive todas las fuentes láser excepto la mi tai. A continuación, coloque un medidor de potencia en la trayectoria del haz óptico y luego seleccione el botón con para activar el escaneo continuo.

Ajuste el porcentaje de transmisión hasta que el medidor de potencia indique una potencia láser promedio de 47 milivatios. Luego detenga el escaneo seleccionando el botón de detener en la pestaña de canales. Deseleccione la fuente láser mi tai y seleccione el hierro de argonne.

Luego, seleccione nuevamente el botón XY rápido en la pestaña de canales y ajuste el diafragma. Detecte la ganancia, amplifique un desplazamiento y amplifique nuevamente con el láser de hierro de Argonne para obtener la mejor calidad de imagen. Utilizando el controlador de la platina, localice y enfoque la célula que desea activar, luego haga clic en el botón de detención. Con la herramienta de recorte, recorte la célula activada de modo que el factor de recorte en la pestaña de modo muestre entre 50 y 70.

Luego detenga el escaneo seleccionando el botón de detener en la pestaña de canales. Deseleccione el láser de iones de argón y seleccione el láser My Tai en la pestaña de modo. Establezca la velocidad de escaneo en 31,46 segundos.

Luego, seleccione el botón individual para iniciar el escaneo para la activación bifotónica del dextrano de fluoresceína encageado de la célula seleccionada. Después de la activación, vaya a la pestaña de canales y ahora desactive el láser mi tai y reactive el láser de ion argón. A continuación, en modo, establezca el factor de zoom en uno. Siguiente.

Bajo el encabezado de velocidad, haga clic en el botón máx. para establecer la velocidad de escaneo más rápida. Para revisar la región activada por la luz, seleccione xy rápido. Luego seleccione la pestaña de canales y ajuste el diafragma y detecte nuevamente; verifique que la región activada por la luz no esté ablacionada por el láser.

Después de preparar los embriones fotoactivados para la detección inmunológica de dextrano marcado con fluoresceína desencapsulado siguiendo el protocolo descrito en el manuscrito adjunto, lave los embriones seis veces en PBT y dos veces en tampón AP. A continuación, transfiera los embriones a placas de nueve pocillos con tampón AP.

A continuación, aspire el tampón AP y agregue N-B-T-B-C-I-P. Detenga el desarrollo de la tinción con N-B-T-B-C-I-P aspirando la solución de N-B-T-B-C-I-P. Luego lave los embriones con PBT.

Ahora recupere los embriones y agítelos en una plataforma rotatoria durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego repita el lavado con PBT dos veces más. Finalmente, monte los embriones en agarosa de bajo punto de fusión al 0,6 % y obtenga imágenes de las células fotoactivadas utilizando un microscopio compuesto invertido.

En esta figura, se muestra a la izquierda una imagen de campo brillante y a la derecha una imagen fluorescente de un embrión de pez cebra microinyectado con una hebra de dextrano de fluoresceína encageada antes de la fotoactivación. Como se muestra aquí, el embrión ha sido fotoactivado en uno de los somitos indicado por la flecha en la figura de campo brillante a la izquierda, con una longitud de onda de 407 nanómetros, un tiempo de escaneo de 31 segundos y una potencia media del láser de 47 milivatios. En la figura de la derecha, tras la fotoactivación, puede observarse la fluorescencia procedente del dextrano de fluoresceína desencageado.

La tinción inmune del dextrano de fluoresceína desencapsulado se muestra en una pequeña región de la placa lateral, mesodermo de un embrión en estadio de 10 so mite, que fue activado por luz mediante los mismos parámetros láser que en la figura anterior, utilizando el procedimiento de detección inmunológica. La región activada, indicada aquí mediante la flecha, puede identificarse con una tinción de fondo mínima tras seguir este procedimiento.

Se pueden realizar análisis adicionales, como tinciones inmunohistoquímicas para diferentes marcadores específicos de tejidos, con el fin de caracterizar mejor la ubicación y el destino de las células marcadas. Mediante esta técnica, se allana el camino para que los investigadores en el campo de la biología vascular estudien el origen de las células progenitoras arteriales y venosas en embriones de pez cebra en desarrollo. No olvide que al trabajar con reactivos químicos como NBT y BCIP, estos pueden ser extremadamente peligrosos y siempre se deben usar guantes.