Los explantes blastómeras para la Prueba de Compromiso destino celular durante el desarrollo embrionario

El método mostrado en este video utiliza mapas de destino del embrión en estadio de segmentación para identificar un solo cultivo de blástula aislado, con el fin de evaluar si el destino embrionario está determinado por instrucciones intrínsecas o extrínsecas. Primero se recolectan embriones de dos células en los que la primera surco de segmentación biseca la zona ligeramente pigmentada del hemisferio animal. Estos embriones se cultivan hasta que alcancen entre 16 y 32 células, momento en el cual se retira la membrana vitelina y se separan mediante disección las células vecinas a la célula seleccionada. Por ejemplo, la blástula diseccionada se transfiere entonces a una depresión en un pozo de cultivo recubierto con agar y se mantiene en cultivo.

Una vez que el explante alcanza la etapa deseada, se cosecha para evaluar la expresión génica o proteica mediante hibridación in situ, QPCR o inmunohistoquímica. La principal ventaja de esta técnica frente a otras, como el cultivo de grandes grupos de células embrionarias u órganos en medio de cultivo, es que se pueden cultivar blasómeros embrionarios individuales cuyo destino de desarrollo es conocido a partir de estudios de trazado de linaje, sin la adición de factores de crecimiento ni la presencia de células vecinas. Así, se puede probar directamente si los factores intrínsecos a la célula inducen a que el blasómero se convierta en precursor de un tejido específico o si requiere señales provenientes de células circundantes.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la disección de Blairs y su transferencia a los pocillos de cultivo requieren manipulaciones delicadas bajo el microscopio estereoscópico. En este video, utilizaré este método para demostrar si los ARNm de origen materno predisponen a las células hacia un destino neural. Trabajando bajo un microscopio de disección, afílese cuatro juegos de pinzas utilizando película abrasiva Illumina.

Un par de pinzas sirve como respaldo en caso de que la punta se dañe durante el procedimiento; esterilice en autoclave las cuatro pinzas y guárdelas en un recipiente estéril. Prepare 500 mililitros de solución salina de Barth modificada (MBS) al 0,1 x y al 1,0 x, y filtre y esterilice ambas soluciones. Almacene estas soluciones durante meses a una temperatura de 14 a 18 grados Celsius en un frasco de vidrio con tapón de rosca. Prepare agarosa al 2% de grado electroforético en 100 mililitros de medio de cultivo 1X. Autoclave para disolver la agarosa y use el microondas para licuar la agarosa cuando sea necesario nuevamente, mientras la agarosa esté líquida.

Vierta aproximadamente 0,5 mililitros en el fondo de cada pocillo de una placa de cultivo estéril de 24 pocillos. Esto evitará que los implantes se adhieran al plástico. Luego, vierta aproximadamente de dos a tres mililitros en el fondo de dos a tres placas de Petri de 60 milímetros e inclínelas suavemente para distribuir el líquido.

Estos servirán como placas de disección y el aros evita que los embriones se adhieran al plástico. Una vez que se les hayan retirado las membranas, cuando el aros se haya enfriado y endurecido, flamee la punta de una pipeta Pasteur de seis pulgadas hasta que se derrita y forme una bola. Refrigere brevemente la bola, luego tóquela ligeramente sobre la superficie del aros en un pocillo de la placa de cultivo.

Esto creará una depresión superficial en la que se colocará el X explan. Repita el procedimiento para cada pocillo de la placa. A continuación, llene cada pocillo de la placa de cultivo con un mililitro de un medio de cultivo estéril x.

Luego, llene el recipiente de disección con MBS 0,1 X para facilitar la separación de los blástulas. Una vez preparados los recipientes de disección, transfiera los huevos fertilizados sin las envolturas de gelatina a placas de Petri de 100 milímetros que contengan medio de cultivo 0,5 x. Los que no se utilicen inmediatamente pueden cultivarse a 14 grados Celsius mientras se examina la primera placa en busca de embriones de dos células.

Examine los embriones en el primer plato de Petri utilizando un microscopio de disección; con una pipeta de transferencia de plástico, transfiera aproximadamente 10 embriones de una célula y de dos células a un plato separado lleno con medio de cultivo al 0,5 x. Coloque el plato de Petri en un incubador a 14 grados Celsius. La capacidad de este ensayo para evaluar con precisión el potencial de desarrollo de una célula depende de la disección del blasmafrodito correcto según los mapas de destino celular.

Por lo tanto, es fundamental elegir embriones con el patrón de pigmentación correcto en la etapa de dos células que, en consecuencia, sigan patrones de escisión regulares. Como se ilustra aquí. Las escisiones regulares a menudo ocurren solo en un lado del embrión.

Estos embriones aún pueden utilizarse como donantes si la célula donante proviene del lado normal. Cuando los embriones alcancen la etapa de dos células, separen aquellos en los que la primera hendidura de escisión divide en dos la zona ligeramente pigmentada del hemisferio animal y colóquenlos en un recipiente aparte; separen aproximadamente cinco veces más embriones de los que serán diseccionados. Estos serán los donantes para el explante.

Mantenga los dos embriones restantes de dos células en un plato separado junto a los embriones donantes durante todo el procedimiento, para utilizarlos como controles hermanos y determinar la etapa del explante. Después de clasificar y diseccionar los embriones, regrese a los platos en el incubador para encontrar más embriones de una y dos células. Dado que los embriones de una célula tardan aproximadamente 90 minutos en dividirse, esto puede hacerse hasta dos horas después de la recolección de los huevos.

Para preparar el explante, coloque de cinco a 10 embriones en un plato de disección. Luego, coloque el primer embrión de modo que la membrana vitelina transparente pueda sujetarse con pinzas. Normalmente no se puede ver, pero puede sujetarse en el polo animal, donde está separada por un espacio perivitelino claro por encima de la superficie del embrión.

Con una pinza afilada en una mano, sostenga a cierta distancia del blaster que va a ser disecado para evitar dañarlo. Luego, con la otra pinza afilada en la otra mano, agarre la membrana cerca de la punta de la primera pinza y tire suavemente en direcciones opuestas para desprender la membrana. El embrión se aplanará una vez que la membrana haya sido retirada.

A continuación, tome una célula vecina con la pinza y utilice esta célula como mango para que la célula que se va a disecar no entre en contacto directo con la pinza en la otra mano; retire suavemente las células vecinas restantes de la blasómera deseada. Si se dirigen a células de la línea media que comparten el mismo destino, estas pueden eliminarse juntas como un par. Finalmente, seccione la célula utilizada como mango.

Recoge el blasfemo o par amere con una pipeta de vidrio Pasteur estéril, evitando burbujas de aire y succión excesiva. Coloca la punta de la pipeta Pasteur bajo la superficie del medio de cultivo en un pocillo de la placa de cultivo X explán, y expulsa suavemente el bláster. Este debe deslizarse dentro de la depresión superficial por gravedad.

Se pueden combinar blasfemos de más de un embrión en un solo explante depositándolos en la misma depresión de una placa de cultivo. Repetiremos este procedimiento con los embriones restantes en la placa de disección uno por uno. Después de aproximadamente 10 embriones, la placa de disección estará llena de restos celulares.

Cuando esto ocurra, cambie al siguiente platillo de disección. Una vez finalizadas todas las disecciones, verifique si los explantes se encuentran en las depresiones superficiales. Si no lo están, pueden colocarse suavemente en la depresión con un lazo de pelo que haya sido esterilizado en etanol al 70 % y secado al aire. Incube los implantes a temperatura ambiente sobre la bancada aproximadamente una hora después de la última disección.

Retire los restos que rodean el explante sanado con una pipeta de Pasteur estéril. Coloque la placa del explante a 14-20 grados Celsius junto al recipiente de Petri que contiene los embriones control hermanos. Los embriones hermanos indicarán la fase de desarrollo del explante blasfemo.

Después de aproximadamente una a dos horas en cultivo, los blastómeros explantados se habrán dividido alrededor de cuatro veces y habrán eliminado la mayor parte de los restos procedentes de las células vecinas dañadas. A las 20 horas, forman pequeñas esferas compactas de células. Cuando los embriones hermanos alcancen la etapa de desarrollo deseada, recolecte el explante.

Estos explantes sobreviven bastante bien, incluso si algunas de las células se desintegran. Por lo tanto, si hay una masa turbia en el cultivo, se explorará con un lazo de cabello o con pinzas para determinar si un explante sano está enterrado dentro. Se recoge el explante en un pequeño volumen de solución de cultivo con una pipeta de vidrio Pasteur y se expulsa suavemente en un fijador o tampón de lisis adecuado para el ensayo que se realizará.

Se disectaron dos blasómeros dorsales o dos blasómeros ventrales en el estadio de 16 células y se cultivaron en un XMBS individual a 14 grados Celsius hasta que los embriones hermanos alcanzaron estadios tempranos de placa neural. Cada muestra se analizó para determinar la expresión de una placa neural zigótica. El gen Sox dos mediante hibridación in situ, que se observa como el producto de reacción azul.

Los resultados de este ensayo demuestran que la mayoría de los blasómeros animales dorsales, que son precursores de la placa neural, pueden expresar SOX2 de forma autónoma, es decir, sin señales adicionales provenientes de otras regiones del embrión. Aquellos especímenes que no expresan SOX2 podrían haber sido identificados incorrectamente en el momento de la disección.

En contraste, ninguno de los blasómeros animales ventrales, que son precursores del epidermis ventral, expresa SOX2. Estos datos indican que los blasómeros animales dorsales tienen una capacidad intrínseca para formar tejido neural, mientras que los blasómeros animales ventrales no la poseen. Algunos de los explantes dorsales también han alargado una morfología indicativa de la formación de mesodermo dorsal.

Estos blastómeros también se diferencian para formar el Noor en el embrión intacto y un cultivo de explante expresa una proteína marcadora de Noor para probar el efecto de alterar los niveles endógenos de un gen neural materno expresado. Se inyectaron ARNm de Fox D cinco en los blastómeros precursores ventrales de ocho células. Como se muestra aquí, la mayoría de los implantes ventrales expresaron SOX dos.

Por el contrario, cuando el nivel endógeno de Fox D cinco se redujo mediante la inyección de oligonucleótidos morfolinos antisentido en los precursores dorsales de ocho células, solo unos pocos explantes dorsales expresaron SOX dos. Estos experimentos indican que la expresión materna de Fox D cinco desempeña un papel en la capacidad intrínseca de los blastómeros dorsales para adquirir un destino neural antes de este procedimiento. Otros métodos, como la inyección en los blastómeros que posteriormente se disecarán, ya sea de ARNm para ganancia de función o de oligonucleótidos morfolinos antisentido para pérdida de función, pueden realizarse para responder preguntas adicionales.

Por ejemplo, ¿qué genes están involucrados en la capacidad intrínseca de las células para dar lugar a un destino de desarrollo específico? Además, se pueden probar factores de señalización conocidos mediante la adición de factores purificados al medio de cultivo. Este enfoque también puede utilizarse para trasplantar blastómeros individuales a ubicaciones novedosas en el embrión intacto.

Esta prueba determina si la célula trasplantada está comprometida con su destino de desarrollo original; esta información es fundamental para definir los mecanismos celulares mediante los cuales una célula embrionaria pluripotente se compromete a convertirse en precursora de un tejido definido.