De corte de carga: una herramienta útil para examinar el grado de acoplamiento Marcador brecha unión entre las neuronas retinianas
12 de enero de 2012
Un método sencillo y práctico para determinar el grado de acoplamiento marcador brecha unión entre neuronas de la retina se describe. Esta técnica le permite a uno para investigar la función de las sinapsis eléctricas entre las neuronas de la retina intacta bajo condiciones de iluminación diferentes y en diferentes momentos del día y de noche.
El objetivo general del siguiente experimento de carga por cortes es examinar el grado de acoplamiento mediante trazadores de uniones en hendidura entre neuronas en la retina intacta bajo condiciones controladas de iluminación. El primer paso se logra cortando las retinas con una hoja afilada sumergida en una solución de neurobiotina, una molécula trazadora que puede difundir a través de los canales abiertos de las uniones en hendidura, pero no a través de las membranas celulares. En el segundo paso, las retinas se incuban en solución de Ringer, lo que permite la difusión del trazador a través de los canales de uniones en hendidura abiertos.
Si el acoplamiento de las uniones en hendidura es débil, la fluorescencia de la biotina neurológica se restringirá a las neuronas retinianas cercanas al corte. En contraste, si el acoplamiento de las uniones en hendidura es fuerte, la fluorescencia se detectará en neuronas retinianas alejadas del corte. La principal ventaja del cargado por corte frente a las técnicas existentes es que es más fácil de realizar en neuronas con cuerpos celulares pequeños en tejido retiniano neural intacto.
También es más fácil controlar las condiciones de iluminación durante la carga en cortes que durante un estudio electrofisiológico de neuronas individuales en tejido retiniano intacto. Debido a que los estímulos luminosos utilizados durante la grabación eléctrica pueden provocar por sí mismos cambios en el acoplamiento de uniones en hendidura, demostrará la técnica el Dr. Chu Choi, un posdoctorado de mi laboratorio. En este procedimiento, se mantiene un pez dorado en oscuridad constante durante el día al menos una hora antes de la cirugía, y todos los pasos siguientes hasta que el tejido retiniano se fija también se realizan durante el día en oscuridad constante; se anestesia profundamente al pez dorado añadiendo 150 miligramos por litro de metanosulfonato al agua del acuario.
Luego sacrifique el pez dorado según las normas federales y universitarias y retire cuidadosamente sus ojos. A continuación, retire la porción anterior de cada ojo. Después, coloque un trozo de papel de filtro sobre la porción posterior del ojo e invierta el papel de filtro y el ojo, de modo que el papel de filtro quede debajo de la porción posterior del ojo.
Ahora, retire suavemente la parte posterior del ojo, incluyendo la esclerótica y el epitelio pigmentario del pez dorado adaptado a la oscuridad. Corte el nervio óptico de la retina neural del pez dorado con un par de tijeras finas. La retina neural del pez dorado, orientada con la cara de los fotorreceptores hacia arriba, debe estar ahora adherida al papel filtro antes de la enucleación, mientras el pez se encuentra bajo anestesia, en cinco mililitros de solución de Ringer con base de carbonato oxigenada, con o sin el fármaco en estudio, agregada a cada pocillo de una placa de seis pocillos tras la disección de la retina neural intacta de la porción posterior del ojo.
Transfiera las retinas a los pocillos durante la oscuridad constante. Luego, selle los pocillos con paraformo y deje que el tejido incube durante 30 minutos. Prepare 100 microlitros de solución trazadora disolviendo neurobiotina al 0,5 % en solución de Ringer inmediatamente antes de cortar a través de la retina.
A continuación, agregue la solución de biotina neuro a una placa de Petri de vidrio. Luego, golpee suavemente el papel filtro al que está adherida la retina sobre una toalla de papel. Para eliminar el exceso de Ringer, sumerja una hoja de bisturí en la solución de biotina neuro y realice un corte radial perpendicular a través de la retina y el papel filtro.
Después de eso, sumerja nuevamente la hoja de afeitar en la solución de biotina neural y corte la retina por segunda vez. Repita este procedimiento hasta cuatro cortes por retina. En este paso, transfiera la retina a solución de Ringer fresca, con o sin fármaco de prueba, durante 15 minutos para permitir la carga y la difusión.
Lávese tres veces con solución de Ringer fresca, medio con o sin fármaco de prueba durante cinco minutos cada uno. A continuación, fije la retina con paraformaldehído al 4 % en solución tampón fosfato 0,1 molar a temperatura ambiente durante una hora. Posteriormente, lave la retina con PBS 0,1 molar durante la noche a cuatro grados Celsius colocándola en un refrigerador al día siguiente.
Incube la retina con estreptavidina Alexa 488 al 2 % en PBS 0,1 molar y Triton X-100 al 0,3 % hasta una concentración final de 10 microgramos por mililitro, y deje incubar toda la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, lave la retina tres veces con PBS 0,1 molar a temperatura ambiente, cada vez durante 10 minutos.
Desprenda la retina del papel filtro en PBS. Luego, utilizando un pincel fino, monte la retina con el lado de los fotorreceptores hacia arriba sobre un portaobjetos con medio de montaje Vector Shield. Transfiera el portaobjetos a un microscopio confocal de barrido láser y tome imágenes con la misma resolución, aumento y ajustes para cada condición experimental, de modo que se puedan realizar comparaciones sobre los efectos de diferentes condiciones experimentales en el grado de acoplamiento mediante trazador funcional de brecha, como se muestra.
Aquí se muestra el grado de acoplamiento mediante trazadores en células fotorreceptoras durante el día en oscuridad constante en comparación con el día en oscuridad constante en presencia de un antagonista selectivo del receptor de dopamina D dos. Téngase en cuenta que el corte con bisturí en ambas imágenes está a la izquierda. Aunque una sola imagen puede contener todas las células marcadas, se recomienda obtener una serie Z del área de interés y proyectarla en una única imagen mostrada.
Aquí se muestra el grado de acoplamiento mediante trazador en las células fotorreceptoras a medida que se avanza secuencialmente a través de un Zack. Tenga en cuenta que el corte con bisturí en esta imagen está en el lado derecho. Para cuantificar el grado de acoplamiento mediante trazador en el navegador de imágenes LSM, abra la imagen, luego haga clic en exportar y guarde la imagen como un archivo TIF de 16 bits sin comprimir; la barra de escala debe incluirse en esta imagen TIF utilizando el software NIH Image J.
Mida la intensidad de fluorescencia del neurobiotina marcado con Alexa 488 a partir de imágenes de baja magnificación de retinas montadas en orificio. Abra el archivo TIFF utilizando el software ImageJ y luego trace una línea recta que corresponda a la barra de escala. A continuación, vaya a Analizar, Establecer escala e introduzca la distancia conocida y la unidad de longitud.
Luego haga clic en aceptar. Ahora las mediciones de fluorescencia pueden presentarse en unidades calibradas, como milímetros. A continuación, seleccione el área de interés utilizando la herramienta de selección rectangular.
El pico de fluorescencia debe estar posicionado en el borde izquierdo de su selección. Asegúrese de que no haya señal fluorescente cerca del borde derecho. Haga clic en analizar y trazar el perfil para los datos de control diurno obtenidos en oscuridad constante.
Se muestra una curva con una disminución exponencial de izquierda a derecha. A continuación, haga clic en copiar en la ventana emergente y péguela en Excel. Ahora hay dos columnas, una que muestra la distancia desde el corte y la otra que muestra la intensidad de fluorescencia en función de la distancia desde el corte.
Como comparación, se repiten los pasos anteriores con datos obtenidos en oscuridad constante durante el día. En presencia de spit bro, divida cada valor de fluorescencia bruta por el valor máximo de fluorescencia para obtener la intensidad de fluorescencia relativa. Copie dos columnas correspondientes a la distancia desde el corte y la intensidad de fluorescencia relativa, y luego péguelas en el software Origin.
Estos pasos se muestran tanto para el control diurno como para la muestra diurna. Ajuste los datos en este punto a los resultados con una función de decaimiento exponencial número uno, y compare los valores de la constante espacial en diferentes condiciones experimentales utilizando una prueba T o ANOVA.
Se muestran funciones exponenciales y análisis estadísticos de los datos de control diurno, piprona diurna y control nocturno para su comparación. Aquí se presentan ejemplos del grado de acoplamiento mediante trazadores en las células fotorreceptoras en la retina de pez dorado adaptada a la oscuridad durante el día A, la noche B y durante el día en presencia de un antagonista selectivo del receptor de dopamina D2, tal como se revela mediante la técnica de carga por corte. Todas las imágenes de microscopía confocal se obtuvieron utilizando los mismos parámetros para permitir la comparación.
En este gráfico, la intensidad de fluorescencia para tres condiciones experimentales se representa en función de la distancia respecto al corte y se ajusta mediante una función exponencial. La técnica de carga por corte se utiliza para cuantificar el grado de acoplamiento por trazador a través de uniones en hendidura mediante el cálculo de los valores de la constante espacial, como se muestra aquí para tres condiciones experimentales. La técnica de carga por corte también puede emplearse para investigar las sinapsis eléctricas entre otros tipos de células en la retina y en otras especies.
Por ejemplo, estas dos figuras ilustran que las células horizontales de tipo A y tipo B del conejo muestran acoplamiento homólogo mediante trazadores tras la carga por corte y difusión de neurobiotina en condiciones de oscuridad adaptada. Hemos utilizado la técnica de carga por corte para estudiar el grado de difusión del trazador a través de las uniones comunicantes entre bastones y conos durante el día y la noche. Además, esta técnica puede utilizarse para determinar si el acoplamiento mediante trazadores entre otras neuronas retinianas está regulado por el reloj retiniano y/o por condiciones específicas de luz y oscuridad.
También puede utilizarse para estudiar el acoplamiento de trazadores entre neuronas en otras regiones cerebrales.
Descripción general
Este artículo describe un método para determinar el grado de acoplamiento mediante trazadores de uniones en hendidura entre neuronas retinianas. La técnica permite investigar las sinapsis eléctricas en la retina intacta bajo condiciones variables de iluminación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología retiniana
- Comunicación celular
Antecedentes
- Las uniones en hendidura facilitan la comunicación entre neuronas.
- El estudio del acoplamiento mediante trazadores puede revelar información sobre la función neuronal.
- Los métodos existentes pueden resultar difíciles para cuerpos celulares pequeños en tejidos intactos.
- Las condiciones de iluminación pueden afectar el acoplamiento de las uniones en hendidura.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método práctico para evaluar el acoplamiento por uniones en hendidura.
- Investigar los efectos de la iluminación sobre las sinapsis eléctricas en neuronas retinianas.
- Mejorar las técnicas existentes para estudiar estructuras neuronales pequeñas.
Métodos Utilizados
- Las retinas se cortan y se cargan con un trazador de biotina neuro.
- La incubación en solución de Ringer permite la difusión del trazador.
- Se analiza la fluorescencia para evaluar la intensidad del acoplamiento.
- Las condiciones experimentales se controlan para minimizar influencias externas.
Resultados principales
- La intensidad de fluorescencia indica el grado de acoplamiento del trazador.
- Los resultados varían según las condiciones de iluminación y la hora del día.
- Se ha demostrado que la carga por corte es efectiva para estructuras neuronales pequeñas.
- Se facilita el análisis comparativo entre diferentes configuraciones experimentales.
Conclusiones
- El método de carga por corte es una herramienta valiosa para estudiar las neuronas retinianas.
- Las condiciones de iluminación afectan significativamente el acoplamiento por uniones en hendidura.
- Esta técnica puede mejorar nuestra comprensión de la comunicación neuronal.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación de la comunicación mediada por uniones en hendidura en neuronas retinianas apoya la validación de dianas en el descubrimiento de fármacos en neurociencia, al permitir la reducción de riesgos mecanicistas de moduladores sinápticos. La técnica de carga por corte proporciona datos cuantitativos de difusión del marcador con resolución espacial bajo iluminación controlada, mejorando la confianza predictiva en estudios iniciales de interacción con la diana. Este enfoque aborda una barrera técnica clave en el estudio de estructuras neuronales pequeñas en tejido intacto, facilitando el desarrollo reproducible de ensayos para la aclaración de vías.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación del acoplamiento de trazadores en uniones en hendidura, como lectura funcional de la intensidad sináptica eléctrica.
- Valor operativo: Apoya la reducción del riesgo biológico mediante mediciones estandarizadas de la difusión de trazadores que aclaran la modulación del blanco por neurotransmisores o fármacos.
- Valor predictivo: Facilita la selección de proyectos al proporcionar valores cuantitativos de la constante espacial que reflejan la eficacia del acoplamiento en distintas condiciones experimentales.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Preparación del ensayo: Genera sistemas biológicos validados (retinas intactas) con permeabilidad de uniones en hendidura adecuada para la selección de compuestos posteriores.
- Reproducibilidad: Permite protocolos estandarizados de carga y difusión de trazadores en oscuridad constante, reduciendo la variabilidad debida a cambios en la conductancia inducidos por la luz.
- Resultado cuantitativo: Produce perfiles de intensidad de fluorescencia que pueden normalizarse y ajustarse a modelos de decaimiento exponencial para comparar entre condiciones.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Apoya la investigación de la regulación circadiana de las uniones de hendidura en la retina, un mecanismo relacionado con los trastornos del procesamiento visual.
- Continuidad traslacional: Conecta la validación inicial del blanco en fase de descubrimiento con la continuidad preclínica, al permitir una evaluación consistente del acoplamiento de trazadores en condiciones de luz/oscuridad.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Proporciona datos sobre los efectos de moduladores (por ejemplo, antagonistas del receptor D2) para orientar decisiones de avance o interrupción del proyecto basadas en evidencia de interacción con el blanco.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir la prueba de hipótesis sobre moduladores de uniones en hendidura antes de la identificación del compuesto líder, y sus resultados informan directamente sobre la confianza en el blanco y el análisis de la vía.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas mediante el aislamiento del efecto de la iluminación y de agentes farmacológicos en la difusión del trazador a través de uniones en hendidura.
- Selección: Proporciona preparaciones de tejido listas para ensayos con difusión cuantificable del trazador, lo que permite una evaluación confiable de los efectos de compuestos sobre el acoplamiento neuronal.
- Análisis: Genera mediciones calibradas de intensidad de fluorescencia y constantes espaciales que permiten la comparación estadística (por ejemplo, prueba T) de la intensidad del acoplamiento entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos al permitir la evaluación de la regulación del acoplamiento del trazador por el reloj retiniano y los ciclos luz/oscuridad, relevantes para modelos de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudiar el acoplamiento por uniones en hendidura en diferentes tipos y especies de neuronas retinianas, reduciendo el desarrollo redundante de métodos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la comunicación sináptica eléctrica.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante la iluminación controlada y procedimientos estandarizados de carga del trazador.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir decisiones más tempranas de continuar/no continuar basadas en datos cuantitativos de interacción con el objetivo.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos empíricos sobre los efectos del modulador en diferentes condiciones temporales y farmacológicas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disección de la retina, manipulación de trazadores y microscopía de fluorescencia en condiciones de oscuridad controlada.
- Depende de instrumentación para microcorte, incubación, imagen confocal y cuantificación de fluorescencia (por ejemplo, ImageJ, Origin).
- Necesita una estandarización entre equipos de los protocolos de iluminación, concentración de trazadores y profundidad de corte para garantizar mediciones de acoplamiento reproducibles.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar la técnica a otros sistemas neuronales o especies con distinto grosor del tejido y permeabilidad de las uniones en hendidura.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de trazadores permeables como la neurobiotina y la imposibilidad de evaluar directamente sinapsis eléctricas que no estén acopladas mediante trazadores.
