Una basada en PCR genotipificación método para distinguir entre las variedades de tipo silvestre y ornamental de Imperata cylindrica

El objetivo principal de este procedimiento es proporcionar un protocolo de genotipado molecular económico y rápido que permita diferenciar entre variedades de Retta cylindrica, comúnmente denominada hierba gon, que no pueden distinguirse únicamente por su morfología. Esto se logra primero identificando y aislándola el tejido de una variedad de hierba gon de interés. El siguiente paso consiste en extraer ADN nuclear y plastidial del tejido recolectado.

A continuación, se realiza la reacción en cadena de la polimerasa sobre el ADN extraído utilizando cebadores específicos para cada variedad que dirigen diferencias de secuencia en la región PLAs turn LF, así como controles positivos y negativos adecuados. El paso final consiste en realizar electroforesis en gel para cada una de las cuatro reacciones de PCR con el fin de visualizar los productos amplificados. En última instancia, la variedad de pasto gon recolectada se determina mediante el análisis de las bandas de productos de PCR específicas para cada variedad observadas en el gel. Las especies vegetales invasoras cuestan a Estados Unidos aproximadamente 3.400 millones de dólares anualmente, causando un daño sustancial tanto a los recursos agrícolas como naturales.

El imparato silvestre Electrica, también conocido como hierba Cogan, es una de las diez peores malezas invasoras del mundo. La hierba Cogan forma extensiones monoespecíficas de rápida propagación que desplazan la vegetación nativa, y a su vez, a los animales que dependen de dicha vegetación. Actualmente, la hierba Cogan infesta 490 millones de hectáreas en todo el mundo y aproximadamente 500 000 hectáreas en los Estados Unidos. Una variedad ornamental de ti de tus centrica se comercializa ampliamente bajo los nombres de tus Centrica, Arbra, Baren rojo y JBG, como también llamaremos a la hierba de sangre japonesa. Se considera que esta variedad es presumiblemente estéril y no invasora, y se valora por sus hojas de color rojo.

Bajo ciertas condiciones, la hierba japonesa de sangre puede producir semillas viables y revertir a una forma completamente verde que es indistinguible de la hierba cogan tipo silvestre. Como puede observarse, ambas poseen hojas verdes y son más grandes que la variedad ornamental tradicional, con hojas más grandes. Además, las plantas revertidas y del tipo silvestre tienen rizomas más grandes que la variedad ornamental, lo que aumenta su potencial reproductivo asexual.

La reversión dificulta la identificación solo mediante morfología. Una tarea complicada. Los métodos moleculares proporcionan un medio para distinguir con precisión plantas invasoras y materiales vegetales que no pueden identificarse mediante medios visuales convencionales.

Los métodos moleculares son fundamentales para proteger contra la propagación y la introducción de plantas invasoras. La aplicación de este protocolo molecular proporciona un medio para distinguir con precisión los reversiones de la hierba japonesa de sangre de la hierba Kogan. Este protocolo puede ayudar a prevenir la coexistencia con la hierba Kogan y la posible formación de híbridos viables.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados, o el análisis AFLP, y otras técnicas como la secuenciación de ADN, es que proporciona un método de genotipificación molecular muy económico y rápido, capaz de distinguir fácilmente entre el pasto kogan silvestre y las variedades de pasto japonés de sangre. La técnica será demostrada por Joseph Hery, un estudiante de pregrado de nuestro laboratorio. Primero, identifique un espécimen de un sitio donde el pasto gon o el pasto japonés de sangre estén creciendo y deban diferenciarse entre sí.

La hierba japonesa de sangre se distingue fácilmente de la hierba gon silvestre por sus hojas de color rojo brillante. Sin embargo, el reversionado de la hierba japonesa de sangre es casi indistinguible de la hierba Kogan, ya que ambos presentan hojas verdes más largas, mayor área foliar y rizomas más grandes que la hierba japonesa de sangre ornamental. Este método puede utilizarse en tejidos foliares frescos, congelados y recientemente secados.

Si se van a almacenar tejidos para la extracción de ADN en una fecha posterior, el mejor método es congelar y almacenar el tejido inmediatamente a menos 80 grados Celsius. Si es necesario almacenarlos secos, coloque el tejido en un sobre de papel y guarde el sobre en gel de sílice deshidratado u otros desecantes activos a temperatura ambiente. Si se va a utilizar tejido fresco, asegúrese de que el ADN se extraiga dentro de las tres horas posteriores a la recolección para evitar su degradación.

Este procedimiento utiliza el mini kit para plantas DNEZ de Kyogen según las instrucciones del fabricante, con una modificación menor. El procedimiento se ha adaptado para usar más de 100 miligramos de tejido fresco o congelado, o más de 20 miligramos de tejido seco. Primero, muela más de 100 miligramos de tejido foliar fresco o congelado, o más de 20 miligramos de tejido foliar seco, hasta obtener un polvo fino, utilizando tres rondas de nitrógeno líquido y moliendo en un mortero y pistilo enfriados.

Pese el polvo congelado de tejido fresco o congelado en alícuotas de 100 miligramos. Si utiliza tejido de hoja seco, pese el polvo en alícuotas de 20 miligramos. Después de este paso, continúe con la extracción de ADN según las instrucciones del fabricante utilizando un espectrofotómetro como la prueba del espectrofotómetro NanoDrop, ADN, calidad y cantidad; los rendimientos adecuados de ADN deben estar entre 50 y 150 nanogramos por microlitro con relaciones 260/280 y 230/280 cercanas a 2,0 como se observa aquí.

Realice la electroforesis utilizando un gel estándar de AROS al 1%. Verifique la presencia de bandas relativamente grandes mayores de 10 KB sin manchado o con poco manchado debido a contaminación por ARN; si la concentración de ADN es alta, diluya las muestras a 70 nanogramos por microlitro para los pasos posteriores. Los cebadores de PCR utilizados en este protocolo, indicados por las flechas roja y verde, se basan en diferencias de secuencia entre la región espaciadora LF del césped de yeso y los genotipos del césped japonés sangriento.

Estas diferencias se presentan en forma de polimorfismos de un solo nucleótido e inserciones y deleciones indicadas por las flechas negras verticales, que permiten el desarrollo de cebadores específicos para cada variedad. Al ubicar los cebadores en los sitios de secuencias únicas, las secuencias de los cebadores se incluyen en la parte escrita del protocolo; para cada muestra de ADN aislado, preparar dos reacciones de PCR de 50 microlitros en tubos de PCR de pared delgada de 0,2 mililitros sobre hielo, utilizando cada conjunto de cebadores según el protocolo escrito. Si la concentración de ADN es baja, se puede añadir más ADN a cada reacción, ajustando simultáneamente la cantidad de agua doblemente destilada libre de nucleasas para que el volumen total de la reacción se mantenga en 50 microlitros.

No utilice más de cinco microlitros de ADN ni más del 10 % del volumen total por reacción, ya que las impurezas presentes en las muestras de ADN podrían inhibir las reacciones de PCR. Para asegurarse de que todos los reactivos de PCR funcionan correctamente, prepare adecuadamente el control positivo. Utilizando los cebadores del control positivo, prepare el control negativo con el mismo conjunto de cebadores de control que el control positivo, pero sustituya el ADN extraído por agua doblemente destilada. En este punto, hay un total de cuatro reacciones de PCR por cada muestra que se analiza. A continuación, realice las amplificaciones por PCR en un termociclador equipado con tapa calefactada, utilizando los parámetros de ciclado de PCR indicados en el protocolo escrito. Puede ser necesario optimizar la temperatura de hibridación de los cebadores, los tiempos de extensión y el número de ciclos, dependiendo de la calidad del ADN, los cebadores, la polimerasa o el tipo de termociclador utilizado.

Una vez completadas las reacciones de PCR, separen los productos de PCR en un gel al 1 % mediante electroforesis estándar. Corran las muestras a aproximadamente 120 voltios hasta que el frente de D alcance tres cuartas partes de la longitud total del gel. Visualicen el gel bajo luz ultravioleta e inspeccionen las bandas resultantes para verificar si se amplificó un fragmento de ADN adecuado.

Este gel representativo muestra los resultados de la electroforesis de productos de PCR derivados de muestras de ADN de hierba Kogan, hierba japonesa de sangre, y reversiones de hierba japonesa de sangre combinadas con cebadores específicos para hierba Kogan y JBG, así como el control positivo turn LF y un control negativo sin molde. El conjunto de cebadores del control positivo turn LF funciona igual de bien para hierba Cogan, hierba japonesa de sangre, reversión de hierba japonesa de sangre y otras gramíneas, y producirá una banda de 890 pares de bases. Si todos los reactivos de PCR están libres de contaminantes de ADN, la reacción del control negativo no dará lugar a un producto de PCR.

Si la muestra de ADN se deriva de la hierba tipo silvestre kogan, una reacción de PCR utilizando el conjunto de cebadores específico para la hierba kogan dará como resultado una sola banda de aproximadamente 595 pares de bases, mientras que los cebadores específicos para JBG no producirán ninguna banda. Asimismo, si la muestra de ADN se deriva de JBG o de una reacción J-B-G-A-P-C-R revertida, el uso del conjunto de cebadores específico para JBG dará como resultado una sola banda de aproximadamente 594 pares de bases, mientras que los cebadores específicos para la hierba kogan no producirán ninguna banda.

Dado que JBG y JBG revertido tienen la misma secuencia de ácido nucleico, tendrán patrones de bandas idénticos. Sin embargo, las diferencias morfológicas entre JBG y los revertidos de JBG son bastante evidentes, por lo que, aunque los resultados de la PCR serán los mismos, las variedades de JBG son fáciles de distinguir a nivel de la planta. La secuenciación de ADN de los productos de PCR puede identificar posibles cambios en las secuencias de ADN para diferentes ecotipos de hierba cogan.

El desarrollo de esta técnica proporciona el primer método molecular simplificado que puede distinguir con precisión entre el tipo silvestre de K y la hierba común y la forma revertida de su variedad ornamental, la hierba japonesa de sangre. Animamos a los usuarios de este protocolo a que se comuniquen con nosotros para informar sobre los resultados obtenidos mediante el uso de este protocolo. Esta información compartida ayudará a proporcionar datos sobre la distribución de la hierba japonesa de sangre.

Esto también ayudará a los reguladores del USDA a tomar decisiones informadas sobre las acciones que podrían ser necesarias para evitar la propagación y la hibridación potencial de las variedades altamente invasoras de pasto Cogan.