De proteínas de membrana de superposición de ensayo: Un protocolo de prueba de interacción entre las proteínas soluble e insoluble In vitro

Prueba de proteína. La interacción proteica es indispensable para la disección de la funcionalidad de las proteínas. Este video presenta un ensayo de unión proteína-proteína in vitro para evaluar la interacción entre una proteína de membrana inmovilizada y una proteína soluble.

Primero, se clonan, expresan y extraen las proteínas de fusión. La proteína insoluble marcada se inmoviliza en una membrana de nitrocelulosa y se trata para volver a plegarla a su conformación nativa. Luego, la membrana se analiza con proteínas solubles marcadas y se realiza un inmunoblot para detectar las proteínas.

Si las proteínas marcadas interactúan, quedan retenidas por la proteína inmovilizada en la membrana, y se observará la señal proveniente del inmunotransferido. Por lo tanto, este ensayo proporciona un método confiable para probar la interacción entre una proteína insoluble y una proteína en solución. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el de captura con GST, es que permite evaluar de manera confiable la unión entre una proteína insoluble y una proteína soluble in vitro.

El primer paso de este procedimiento consiste en generar proteínas marcadas genéticamente para su detección. Comience clonando la proteína que será inmovilizada sobre la membrana. Denominada aquí como pro Im (proteína inmovilizada) en un vector de expresión que codifique una etiqueta grande, como GST; el vector de expresión vacío, que codifica únicamente la etiqueta, se utilizará como control negativo de proteína inmovilizada y se denomina pro IM nc.

A continuación, clone la proteína que se utilizará como sonda soluble en un vector de expresión, que codifique una etiqueta diferente, como strep dos. Esto se denominará prosol para proteína soluble como control negativo; clone una proteína soluble de control negativo en el mismo vector de expresión. Esto se denominará Prosol NC para proteína soluble de control negativo.

A continuación, utilice un sistema de expresión proteica, como *E. coli* o el virus baculovirus, para expresar las proteínas marcadas. El sistema de expresión empleado debe elegirse cuidadosamente según los requisitos de modificaciones postraduccionales. Extraiga las proteínas expresadas del organismo seleccionado. Para pro IM y pro I mnc Resus.

Suspenda las células en tampón de carga para SDS-PAGE que contenga una mezcla de inhibidores de proteasas. Luego, hierva las células durante cinco minutos y, a continuación, centrifúguelas para eliminar el precipitado y extraer Prosol y prosol NC. Utilice procedimientos estándar. El pro IMS se puede extraer en condiciones desnaturalizantes porque las proteínas se volverán a plegar después de ser inmovilizadas en la membrana de nitrocelulosa.

Sin embargo, se debe extraer el prosol para obtener una conformación nativa, ya que se añadirá al tampón de unión una vez que se hayan extraído las proteínas marcadas. Determine la concentración de las proteínas recombinantes utilizando un método estándar, como el kit de ensayo de proteínas de BioRad. Si se utilizará extracto crudo en lugar de proteína purificada para el ensayo.

Estime la concentración de la proteína de interés mediante densitometría de escaneo de la banda correspondiente en un gel de poliacrilamida SDS teñido con kumasi, utilizando concentraciones conocidas de albúmina sérica bovina (BSA) como referencia. Luego, trace la curva estándar basada en las intensidades de señal medidas por densitometría de escaneo de la BSA y calcule la cantidad de proteína contenida en el extracto crudo.

El siguiente paso del procedimiento consiste en inmovilizar el pro Iam y el pro IAM NC en la membrana. Comience cargando un microgramo, de cada uno de los extractos de pro Iam y pro IAM NC, en duplicado sobre un gel de poliacrilamida SDS. Después de la electroforesis, retire el gel de las placas de vidrio y colóquelo en 100 mililitros de tampón de transferencia, luego incube con agitación suave durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Tras la incubación, realice un inmunotransferencia western para transferir las proteínas a una membrana de nitrocelulosa después de la transferencia, con el fin de permitir que las proteínas unidas a la membrana se replieguen. Coloque la membrana en 15 mililitros de tampón A e incube con agitación suave. Para eliminar el SDS residual, incube durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación suave.

Después de la incubación, retire cuidadosamente la membrana del tampón. Luego coloque la membrana en 25 mililitros de tampón de desnaturalización. Incube durante dos horas a temperatura ambiente con agitación suave.

Durante la incubación, la membrana de nitrocelulosa se volverá opaca. A continuación, utilizando pinzas, transfiera la membrana a 25 mililitros de TBS e incúbela con agitación suave durante cinco minutos. Durante este paso, la membrana recupera su color blanco original.

A continuación, transfiera la membrana a 25 mililitros de tampón de unión. Incube a cuatro grados Celsius con agitación suave durante la noche. A continuación, la proteína soluble se utilizará para detectar la proteína inmovilizada en la membrana.

Primero, prepare los tampones de hibridación diluyendo de uno a diez microgramos de prosol y prosol NC en tubos separados que contienen 10 mililitros de tampón de unión fresco. Luego, transfiera el tampón a una bolsa de hibridación. A continuación, corte la membrana en dos tiras, ambas conteniendo pro IM y pro IAM nc.

Estas membranas se colocarán en el tampón de hibridación. Transfiera cada membrana a la solución de hibridación prosol o prosol NC e incube durante 1,5 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Retire las membranas de las soluciones de hibridación y enjuague tres veces durante 15 minutos en TBS.

Para visualizar interacciones proteína-proteína, bloquee la membrana con leche descremada al 2,5 % en TBST durante una hora. Después de la incubación, coloque las membranas bloqueadas en la solución de anticuerpo primario. Aquí se utiliza el anticuerpo policlonal de conejo antisestreptavidina dos.

Incubar durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave tras la incubación. Enjuagar las membranas con 20 mililitros de TBST durante 15 minutos y luego dos veces durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación suave. A continuación, colocar las membranas en la solución de anticuerpo secundario conjugado a HRP. Aquí se utiliza un anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado a HRP.

Incubar durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave. Enjuagar las membranas con 20 mililitros de TBST durante 15 minutos y luego dos veces durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación suave como antes; tras el enjuague final en TBS, visualizar la interacción proteína-proteína utilizando un sustrato quimioluminiscente HRP de Here Millipore. Im Molan Western Chemiluminescent.

Se utiliza sustrato de HRP después del inmunoensayo sobre la prosol. Lave la membrana con TBST durante 15 minutos y luego dos veces durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a ensayar las membranas con el anticuerpo primario para la etiqueta de pro.

Incube con el anticuerpo secundario adecuado. Visualice PRO I y pro Im NNC mediante la detección de quimioluminiscencia para validar la identidad de las bandas obtenidas en el ensayo de superposición en membrana proteica. La interacción entre las proteínas A y K y YFP y MP CYFP se evaluó en células epidérmicas de tabaco utilizando el método descrito en este video, como se muestra aquí.

Cuando se evaluó la complementación de fluorescencia biomolecular, se reconstruyó una señal fuerte de YFP. Esta señal de BFC se acumuló en puntos en la periferia celular, que son característicos del plasma debido a que MP es una proteína altamente insoluble. Cuando se expresó en bacterias o en plantas, se adoptó el ensayo de superposición de proteínas de membrana para validar esta interacción.

Se separaron extractos proteicos in vitro que contenían un microgramo de GST MP o GST sin fusión mediante electroforesis en gel de poliacrilamido SDS, seguido de la transferencia electrofórica a una membrana de nitrocelulosa. Cuando estos perfiles proteicos se analizaron con GST MP soluble etiquetado con strep dos, solo el GST MP, y no el GST sin fusión, mostró unión. Además, cuando el mismo conjunto de perfiles proteicos se analizó con una proteína no relacionada, la quinasa de NADH citoplasmática de Arabidopsis etiquetada con strep dos, no se observó unión, lo que demuestra aún más la especificidad de la interacción A NK MP. Al intentar este procedimiento, es importante recordar recargar adecuadamente las proteínas inmovilizadas siguiendo el protocolo presentado.