Evaluación de la migración de las células madre del cáncer compartimentar Utilizando dispositivos de microfluidos y imágenes de células vivas

El objetivo general de este procedimiento es inspeccionar visualmente y caracterizar la migración de células cancerosas a través de un dispositivo microfluídico compartimentalizado. Esto se logra primero disociando neuroesferas preexistentes de células madre de tumores cerebrales cultivadas en medio libre de suero. El segundo paso consiste en fabricar un molde maestro de SU-8 bicapa y utilizar una técnica de litografía blanda con un sello A-P-D-M-S que tenga un diseño compartimentalizado.

A continuación, ensamble el dispositivo microfluídico y cárguelo con células madre de tumores cerebrales. Finalmente, se logra la adquisición de imágenes de lapso de tiempo prolongado de la migración de células madre de tumores cerebrales mediante un sistema microscópico todo en uno. En última instancia, los resultados muestran que las células madre de tumores cerebrales exhiben una secuencia giratoria de etapas morfológicas durante su migración a través de espacios ultraconfinados.

La principal ventaja de esta técnica frente a sistemas existentes como la cámara Transwell Boyton es que el microdispositivo permite la inspección visual del proceso de migración, la colocación controlada de células y la administración precisa de factores. Por lo tanto, la tecnología microforica posee características de selección y navegación celular individual fiable, eficiente y rentable. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la metástasis y la recurrencia del cáncer, ya que el análisis de células individuales altamente migratorias podría identificar posibles dianas futuras para la quimioterapia.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el comportamiento migratorio del sistema canceroso, también puede aplicarse a otros sistemas, como el desarrollo embrionario, las respuestas inmunitarias, la cicatrización de heridas y la regeneración de órganos. Comience con la suspensión celular de neuroesferas derivadas de BTSC. Reúna las células en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifúgelas a 900 RPM durante cinco minutos, pero no más rápido.

Aspire el sobrenadante. A continuación, permita que las neuroesferas se suelten incubándolas en 0,5 mililitros de Accutase precalentado durante cinco a 10 minutos a 37 grados Celsius. Después de la incubación, disgregue mecánicamente las células mediante 10 a 20 pipetadas suaves con una pipeta P100.

Luego, agregue 1,5 mililitros de medio para células madre para neutralizar la centrifuga de Accutase, centrifugue la suspensión celular a 1300 RPM durante cinco minutos y resuspenda las células en un mililitro de medio para células madre. Verifique la densidad celular con un hemocitómetro y ajuste la densidad a 20.000 células por microlitro. Para comenzar la fabricación del molde maestro SU-8, prepare dos máscaras fotolitográficas utilizando Adobe Illustrator y película de transparencia con impresión láser mediante Image Setter incorporado.

La máscara fotolitográfica de la primera capa consta de dos marcadores fiduciales y una matriz de microcanales, y la segunda capa de la máscara fotolitográfica tiene las cámaras de asiento y recepción. Limpie ambas capas de la máscara con isopropanol y déjelas secar al aire. Ahora, aplique por centrifugado un sustrato portador con una resistencia fotolitográfica SU-8 de tres micrones de espesor, seguido de un horneado suave.

Luego, con la máscara fotolitográfica de la primera capa en contacto cercano con la luz ultravioleta, exponga la foto, el resist y deje que se cure. A continuación, hornee posteriormente y revele la oblea curada. Cubra las áreas de los marcadores de referencia de la oblea de manejo con cinta adhesiva transparente.

Luego, aplique por centrifugado una oblea con una resistencia fotográfica de 250 micrones de espesor. Posteriormente, retire la cinta para revelar los marcadores con fines de alineación. Coloque la segunda capa de resistencia fotográfica y alinee los marcadores fiduciales.

Luego exponga a UV y cure la máscara fotográfica de la segunda capa, seguido de horneado posterior y revelado. Ahora, silanice el molde de SU-8 mediante deposición de vapor para reducir la adherencia superficial. Coloque las obleas en un desecador con varias gotas de solución de triclorosilano bajo vacío durante al menos una hora.

El molde maestro estará entonces listo para usar y moldear PDMS con el maestro. Comience mezclando completamente la base del prepolímero con el agente de curado en una proporción de 10 a 1. Luego, coloque la mezcla en un desecador para desgasificación al vacío hasta que no se observe ninguna burbuja de aire.

Vierta la mezcla sobre la máscara y desgasifique nuevamente. Si se introducen nuevas burbujas de aire, cure el molde en una placa calefactora nivelada durante dos horas a 90 grados Celsius. Después de que se enfríe a temperatura ambiente, retire suavemente el sello de PDMS.

Por lo tanto, los canales de cultivo están grabados en PDMS y listos para el ensamblaje del dispositivo microfluídico. El molde maestro se puede reutilizar para moldear hasta que se agriete o desgaste. Cuando el molde maestro se vuelva pegajoso, se puede volver a aplicar el recubrimiento antiadherente.

Comience creando entradas y salidas en el dispositivo microfluídico a través del sello de PDMS. Utilizando una punción con aguja de biopsia, limpie el sello de PDMS sumergiéndolo en etanol al 70 % durante 30 minutos y luego enjuagándolo con agua desionizada durante 10 minutos. Esterilice y complete las reacciones de reticulación del sello de PDMS mediante autoclave.

Ahora coloque el sello de PDMS sobre un cubreobjetos de vidrio recubierto con poli-L-lisina. Luego, el dispositivo se recubre con laminina llenando las cámaras con solución de laminina a través de las entradas de los depósitos y se incuba durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, aspire la laminina del dispositivo.

Luego, lave el dispositivo inundándolo dos veces con medio de células madre. Ahora, cargue 11 microlitros de células disociadas en uno de los reservorios de siembra. Si es necesario, use aspiración al vacío para forzar la entrada de las células en la cámara. A continuación, cargue siete microlitros adicionales de células en el reservorio de asiento adyacente.

Después de cinco minutos, los compartimentos de asiento y recepción se inundarán con medio. Coloque ahora una lámina estéril de PDMS de entre 0,5 y un milímetro de grosor sobre el dispositivo. La adhesión natural de la superficie del PDMS consigo mismo sellará el dispositivo; una vez sellado, estará listo para su transporte, incubación e imagen microscópica.

Preecuilibre el biot, IM haciendo funcionar el equipo durante 45 minutos. Para estabilizar su temperatura, humedad y suministro de aire, agregue varios recipientes con agua a la cámara de muestra para obtener la humedad adecuada. Coloque el dispositivo preparado en la cámara de muestra del microscopio.

Centre el dispositivo utilizando pinzas microscópicas. Ahora configure los puntos de enfoque y los puntos de tiempo utilizando el software Biot e inicie las grabaciones lapseadas si es necesario. Después de cinco días en cultivo, reemplace el medio de cultivo.

Los BTC sembrados en el dispositivo fueron registrados continuamente mediante imagen de contraste de fase. Durante cinco días en la cámara de asiento, las células con forma de huso permanecieron en la etapa pre-migratoria. A medida que se acercaban a la entrada del microcanal, algunas células se expandieron y generaron protrusiones adhesivas.

Solo una célula pudo ocupar la entrada y explorar la dirección de migración. Una vez que la célula determinó la dirección de migración, avanzó a lo largo de todo el microcanal a una velocidad constante y alta. Al final del microcanal, la célula procedió a explorar el espacio abierto de la cámara receptora antes de entrar finalmente en ella.

Al observar las células con intervalos de imagen de dos segundos, parecía que la energía para la migración se generaba principalmente mediante una actividad de protrusión similar a la de células OID. Al intentar el procedimiento, es importante recordar que el diseño del dispositivo es tan flexible que las dimensiones de los microcanales pueden manipularse para lograr un grado deseado de migración celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear un dispositivo microfluídico compartimentalizado único, adecuado para el cultivo de sus células de interés, y luego realizar imágenes de lapso de tiempo a largo plazo para definir cualitativa y cuantitativamente las características migratorias de estas células siguiendo este procedimiento.

Otros métodos como la secuenciación de próxima generación o los microarreglos de ADN pueden aplicarse para responder preguntas adicionales, como cuán diferentes genéticamente son las células cancerosas altamente migratorias.