La construcción de un láser de bajo presupuesto axotomía Sistema para el Estudio de la regeneración de axones en C. elegans
15 de noviembre de 2011
La axotomía con láser seguida de imágenes de lapso de tiempo es una técnica sensible para evaluar los efectos de mutaciones en C. elegans sobre la regeneración de axones. Un sistema de ablación láser de alta calidad pero económico puede agregarse fácilmente a la mayoría de los microscopios. La adquisición de imágenes de lapso de tiempo durante 15 horas requiere una inmovilización cuidadosa del gusano.
El objetivo general de este procedimiento es mostrar cómo montar y alinear un sistema de ablación láser para estudiar la regeneración de axones en CL gans. Esto se logra primero montando un láser, la glándula láser, el polarizador Thompson, la placa de media onda, el espejo giratorio, el periscopio, el riel y el espejo del riel sobre una placa de montaje. El siguiente paso del procedimiento consiste en alinear el haz láser con el haz emergente del lente condensador del microscopio.
Luego se montó, alineó y posicionó la lente del expansor del haz láser para centrar el haz y hacerlo con divergencia nula. El paso final del procedimiento consiste en hacer que el punto de ablación láser coincida con el enfoque de la imagen mediante ajustes finos. En última instancia, es posible cortar con precisión axones de medio micrómetro con daño mínimo en los tejidos colindantes utilizando un haz láser limitado por difracción cuando la alineación NC XY es imperfecta.
La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los láseres de femtosegundo es que es relativamente económica, con un costo de 15,000. Es prácticamente libre de mantenimiento y permite un corte muy preciso de axones. Aunque este método puede proporcionar información sobre la regeneración de axones en *C. elegans*, también puede aplicarse a otros sistemas, como moscas, pez cebra, ratón, sistema nervioso periférico y células *in vitro*.
Básicamente, cualquier célula que se encuentre a entre 30 y 50 micrómetros de la superficie. Comience con los componentes colocados en la placa de pruebas y sujete con pernos el poste del periscopio láser y los soportes elevados del riel. Este sistema utiliza un láser de Clase tres B que puede dañar fácilmente los ojos, así que por favor tome muy en serio las medidas de seguridad con láser.
Hable con alguien de su departamento local de física sobre cómo trabajar de forma segura con láseres de haz libre. Siempre durante el proceso de alineación, configure el láser a la potencia más baja. Cuando mire a través de los oculares, asegúrese de que el láser esté cerrado mecánicamente y de que esté apagado.
Ahora, posicione primero el microscopio, alineándolo con el eje del riel. Segundo, alinéelo con el haz de luz transmitida procedente de la lente del condensador del microscopio. Tercero, alinee ambos extremos del riel con el haz del condensador utilizando una abertura ajustable o una lente fijada al riel.
Utilice un nivel y gatos de laboratorio para ajustar la altura del riel antes de continuar. Asegúrese de que ambos extremos del riel estén alineados. Ahora, verifique que el haz láser atraviese la glándula, el polarizador de Thompson y la placa de media onda, y que no toque sus bordes durante la rotación.
La placa intermedia ajustará la potencia del láser con todos los componentes fijados en la placa base. Encienda el láser, configure la frecuencia de pulso en modo continuo a 100 y reduzca la potencia al mínimo utilizando la placa intermedia. Utilice una nota adhesiva o papel para lentes para visualizar el haz del láser.
Ahora, para elevar el haz láser desde la plataforma. Ajuste y fije los espejos montados cinemáticamente en secuencia, desde el láser, para dirigir el haz hacia el espejo que está montado en el extremo del riel elevado. Al finalizar, el haz láser debe estar alineado aproximadamente con el centro de los espejos, y los espejos deben estar orientados aproximadamente a 45 grados respecto al eje del haz láser antes de alinear el haz láser con el haz de luz transmitida del microscopio.
Retire o abra todos los filtros ND y diafragmas en el módulo intermedio. Ahora comenzamos el paso más crítico para lograr un corte preciso de los axones sin daño colateral excesivo. Vamos a alinear el láser con precisión en los ejes x, y y z con la potencia láser más baja posible para obtener el punto de ablación más pequeño.
El haz láser y los haces de luz transmitida pueden verse simultáneamente sobre un papel. Coloque el papel cerca del puerto del microscopio para comenzar. Ahora inicie el alineado del láser utilizando los ajustes gruesos del espejo en la parte superior del periscopio y del espejo en el extremo del riel.
Coloque un papel entre la lente del condensador alineado y la torreta de objetivos abierta. Continúe utilizando los ajustes finos del espejo de riel para alinear el haz láser al centro del haz de luz transmitida más amplio. Ahora, fije el microscopio en su lugar con abrazaderas.
Se pueden encontrar pasos adicionales sobre la evaluación del alineamiento del láser en el manuscrito escrito. Deben instalarse expandidores de haz galileanos duales para ampliar 33 veces el haz de láser de 300 micrones y llenar la apertura posterior del objetivo de 10 milímetros. Comience montando las cuatro lentes en sus portadores.
Luego, fije las lentes al riel de manera que todas estén en el mismo eje óptico y exactamente ortogonales al haz láser. Encienda el láser y ajústelo a la potencia mínima y al modo continuo. Ajuste aproximadamente la alineación del haz a través de cada lente.
Utilice papel para ver el haz. Ahora apague el láser. Coloque un obturador de seguridad en el láser y retire el microscopio del camino del haz láser.
Encienda nuevamente el láser y visualícelo contra una pared cercana. Utilice el ajuste fino de las lentes para expandir el haz. Luego, ajuste los dos últimos espejos montados cinemáticamente para alinear el haz en un círculo de brillo uniforme en la posición estimada de la abertura trasera del objetivo.
Observe el tamaño y la uniformidad del haz sobre el papel. Luego, ajuste el haz a convergencia cero observando cómo cambia el tamaño del haz al mover el papel más lejos de la lente. Apague el láser y active el obturador mecánico.
Deslice el microscopio nuevamente hacia la trayectoria del haz láser utilizando las abrazaderas fijas para definir la alineación correcta. Coloque las abrazaderas en el lado libre del microscopio, pero no las apriete. Ahora encienda el láser.
Retire el obturador de seguridad y gire la torreta de objetivos hacia una posición abierta utilizando papel en la platina; debe observarse un haz láser expandido y uniforme centrado sobre el haz de luz transmitida proveniente del condensador. Si los haces no están centrados, ajústelos aflojando las abrazaderas del microscopio y desplazando cuidadosamente el microscopio. Ahora active el obturador de seguridad y configure el láser en modo de disparo.
Gire el objetivo de 60 aumentos en su lugar. Ahora, obtenga una imagen de los arañazos superficiales en una platina objetivo. Retire la cubierta de seguridad, active el láser de ablación y ajuste la potencia del láser para obtener el punto de ablación mínimo.
El punto debe ser circular y estar dentro de cinco a 10 micrones del centro de la imagen, centro, el punto de ablación. Utilizando los ajustes finos del espejo de riel montado cinemáticamente para mantener el punto centrado y el perfil del haz uniforme, será necesario ajustar de forma iterativa el espejo montado en el riel y el espejo del periscopio superior. Evalúe el enfoque Z del láser moviendo el enfoque sistemáticamente hacia arriba y hacia abajo en pasos de un micrón, activando el láser de ablación en cada paso.
Si el haz está correctamente expandido y alineado, y con la convergencia ajustada adecuadamente, entonces debería ablacionar de forma máxima en el foco de la imagen y débilmente o nada en absoluto, un micrómetro por encima o por debajo del foco. Si el punto máximo de ablación se encuentra por encima o por debajo del foco de la imagen, realice los ajustes finales al enfoque Z del haz expandido moviendo la lente L tres del telescopio galileano hasta que la ablación láser coincida con el foco de la imagen. Los nematodos se montaron en una portaobjetos personalizada y los axones se ablacionaron utilizando el sistema construido de laserexo somía, y la adquisición de imágenes por intervalos de la regeneración axonal fue muy robusta.
Mediante el uso de una platina motorizada, fue posible cortar e imaginar rutinariamente cinco axones en cinco animales diferentes sobre un solo portaobjetos. El tiempo de adquisición de imágenes para los axones fue el factor limitante.
Aproximadamente el 10 % de los experimentos produjeron películas de lapso de tiempo de alta calidad. Los experimentos restantes proporcionaron todos datos buenos, pero eran estéticamente menos atractivos debido a pequeños movimientos de temblor del gusano que generalmente comenzaban después de cinco a ocho horas de inmovilización. Al intentar este procedimiento, siempre es fundamental evaluar con precisión la alineación del láser en los ejes x, y y Z.
El problema más común que tienen las personas al intentar cortar axones es el daño colateral o la imposibilidad total de cortarlos, y esto casi siempre se debe a un láser mal alineado. Este sistema de ablación láser y la técnica para visualizar la regeneración de axones en c Agains permitirán evaluar rutinariamente el efecto de cualquier mutación genética sobre la regeneración de axones. NCL Agains.
Descripción general
Este artículo describe un método para armar y alinear un sistema de ablación láser para estudiar la regeneración de axones en C. elegans. La técnica permite el corte preciso de axones con daño colateral mínimo, lo que la convierte en una herramienta valiosa para investigadores en neurociencia.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- biofísica
- Biología celular
Antecedentes
- La regeneración axonal es fundamental para comprender los mecanismos de reparación neural.
- Los métodos tradicionales de corte axonal pueden causar daños colaterales significativos.
- La ablación con láser ofrece una alternativa precisa para estudiar la regeneración.
- C. elegans sirve como organismo modelo para investigar estos procesos.
Objetivo del estudio
- Demostrar el montaje y alineación de un sistema de ablación láser.
- Proporcionar un protocolo para estudiar la regeneración de axones en C. elegans.
- Destacar las ventajas de este método frente a las técnicas existentes.
Métodos Utilizados
- Montaje de los componentes láser sobre una placa de pruebas.
- Alineación del haz láser con la trayectoria óptica del microscopio.
- Uso de un láser de Clase 3B para el corte preciso de axones.
- Adquisición de imágenes con lapso de tiempo para monitorear la regeneración axonal durante 15 horas.
Resultados principales
- El sistema de ablación con láser permite cortar axones con daño mínimo.
- El alineamiento preciso es fundamental para obtener resultados óptimos.
- El método puede adaptarse para su uso en diversos organismos modelo.
- La imagen con lapso de tiempo capta eficazmente el proceso de regeneración.
Conclusiones
- Esta técnica de ablación con láser es una herramienta rentable para la investigación en neurociencia.
- Proporciona información sobre los mecanismos de regeneración axonal.
- La adaptabilidad del método lo hace adecuado para una amplia gama de sistemas biológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los sistemas económicos de axotomía con láser permiten el análisis cuantitativo y escalable de los mecanismos de regeneración axonal en organismos modelo transparentes. Este enfoque apoya la validación temprana de objetivos y la reducción del riesgo mecanicista en carteras de neuroregeneración, al proporcionar modelos de lesión precisos y reproducibles. La accesibilidad económica y la adaptabilidad del sistema facilitan su adopción más amplia entre equipos de descubrimiento, acelerando la investigación basada en hipótesis en la reparación neural.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite lesionar axones de manera controlada para la validación funcional de vías de regeneración.
- Apoya la desestimación mecanicista al minimizar los efectos colaterales en los tejidos durante la axotomía.
- Facilita la prueba rápida de hipótesis sobre intervenciones genéticas o farmacológicas en la reparación neural.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona un ensayo estandarizado y reproducible para cuantificar fenotipos de regeneración axonal.
- Ofrece ablación de alta precisión con variabilidad mínima, lo que permite flujos de trabajo robustos de cribado.
- Permite la integración de imágenes de lapso de tiempo, posibilitando la evaluación dinámica de las respuestas regenerativas.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Ofrece una plataforma adaptable a múltiples sistemas modelo, que apoya la continuidad traslacional.
- Permite estudios comparativos entre especies para la validación preclínica de dianas neuroregenerativas.
- Facilita la alineación de los resultados fenotípicos con modelos de lesión neural relevantes para la enfermedad.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este sistema de axotomía láser se integra en la fase de descubrimiento temprano hasta la preclínica, permitiendo estudios iterativos de validación de dianas y estudios mecanicistas antes de la identificación del compuesto líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis nula y la interrogación de vías en la regeneración neural.
- Cribado Proporciona lecturas cuantitativas reproducibles para el regrow de axones en diferentes condiciones experimentales.
- Análisis: Permite la medición precisa de los resultados regenerativos y la comparación estadística de intervenciones.
- Investigación traslacional Facilita la adaptación a diversos organismos modelo para la validación entre especies.
- Reutilización Empresarial: Proporciona una plataforma modular y rentable para uso repetido en neurobiología&D programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los objetivos de reparación neural al permitir modelos de lesión precisos y cuantitativos.
- Valor operativo: Reduce las barreras técnicas y financieras para estudios de regeneración axonal de alto rendimiento.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción mediante la estandarización de la evaluación del fenotipo regenerativo.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de activos en neuroregeneración mediante una validación temprana robusta.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en alineación óptica y protocolos de seguridad con láser.
- Necesita acceso a infraestructura básica de microscopía y montaje sobre placa de pruebas.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos para lograr condiciones de lesión e imagen reproducibles.
- Adaptable a diversos sistemas modelo transparentes ubicados a 30–50 micrones de la superficie del tejido.
- La precisión depende de un alineado meticuloso y una calibración regular para evitar daños colaterales.
